基于多成分和總鞣質(zhì)測定的藏藥大三果及其鞣質(zhì)部位質(zhì)量研究＊

葉 婷，崔雅萍，梁林金，梁文儀，簡 平，周 坤，吳玲芳，李 師，亓 旗，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

大三果由訶子、毛訶子和余甘子3味藥組成，3種果實(shí)常配伍使用，或以它們?yōu)橹魉幣湮闉槿麥ⅲ麥葎┬?，故簡稱大三果[1]。大三果最早見于藏醫(yī)藥《四部醫(yī)典》[2]，1995年版藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)將其收載[3]。隋唐時(shí)期經(jīng)印度傳入我國，據(jù)記載，大三果已被用于印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)超過1000余年。在阿育吠陀傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，大三果可以促進(jìn)疾病的恢復(fù)與痊愈，具有保健作用，應(yīng)用十分廣泛[4-6]。大三果主要含有鞣質(zhì)類、酚酸類、三萜酸類及黃酮類等化合物，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)大三果在抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗菌、抗炎、強(qiáng)心、保肝、化療保護(hù)等方面均表現(xiàn)出一定的治療和預(yù)防保健作用[7-11]。2015版中國藥典將沒食子酸作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)余甘子的質(zhì)量，而對(duì)訶子、毛訶子無明確的質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，有學(xué)者對(duì)訶子[12，13]、毛訶子[14，15]及余甘子[16-18]采用HPLC法對(duì)其藥材中的多個(gè)成分（沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京等）的含量進(jìn)行測定，也有學(xué)者采用HPLC法同時(shí)測定三果湯水提物中沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸的含量[19]。本文建立分光光度法測定總鞣質(zhì)及HPLC法同時(shí)測定大三果及其鞣質(zhì)部位中沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸等3個(gè)成分含量的方法，為大三果及鞣質(zhì)部位的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

儀器：Agilent 1100型高效液相色譜儀；Agilent chemstation b.04.03軟件；十萬分之一電子分析天平：Sartorious BT 25S型（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（功率：100 W，型號(hào)：KQ-500DE昆山超聲儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)：TU1810（普析通用公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本，型號(hào)：N-1000）。

表1 流動(dòng)相梯度

圖1 供試品與對(duì)照品HPLC譜圖

1.2 材料

藥材：余甘子、訶子和毛訶子藥材均購自北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地尼泊爾），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系閻玉凝教授鑒定，分別為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.、使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.及毗黎勒 Terminalia bellirica（Gaertn.）Rox.的干燥成熟果實(shí)。沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)17022801）、柯里拉京對(duì)照品（批號(hào)17033002）、鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)17052603），均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。

試劑：甲醇（Fisher Scientific，色譜純）；蒸餾水（屈臣氏）；其他試劑均為分析純。磷鉬鎢酸試液（自制）；29%碳酸鈉溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC含量測定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

沒食子酸對(duì)照品溶液：精密稱取沒食子酸對(duì)照品4.55 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對(duì)照品溶液。

柯里拉京對(duì)照品溶液：精密稱取柯里拉京對(duì)照品3.45 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為柯里拉京對(duì)照品溶液。

鞣花酸對(duì)照品溶液：精密稱取鞣花酸對(duì)照品2.08 mg于25 mL容量瓶中，加少量二甲亞砜溶解并用50%甲醇稀釋至刻度，作為鞣花酸對(duì)照品溶液。

混合對(duì)照品溶液：精密吸取等量上述對(duì)照品溶液，混勻，制成混合對(duì)照品。

2.1.2 大三果及其鞣質(zhì)部位供試品溶液的制備

大三果供試品溶液：按1∶1∶1比例稱取三種藥材，混合，粉碎（過50目篩），混勻，為大三果供試品。取大三果粉末300 mg，精密稱定，置100 mL三角瓶中，精密加入50%甲醇60 mL，稱重，超聲60 min，補(bǔ)足減失重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

大三果鞣質(zhì)部位供試品溶液：采用課題組建立的提取純化方法，取一定量等比例余甘子、訶子以及毛訶子藥材，粉碎，提取，過大孔樹脂純化，洗脫液回收至小體積，減壓干燥，即得大三果鞣質(zhì)部位。取大三果鞣質(zhì)部位粉末21 mg，精密稱定，精密移取60 mL 50%甲醇置100 mL三角瓶中100 MHz超聲60 min，補(bǔ)足原重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 高效液相色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A（甲醇）：（B）0.1%甲酸水，其梯度（表1）；流速為1 mL·min-1；檢測波長：270 nm。分別吸取混合對(duì)照品溶液、大三果藥材供試品溶液和大三果鞣質(zhì)部位供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，按下列流動(dòng)相梯度洗脫，色譜圖（圖1）。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL；柯里拉京對(duì)照品溶液4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL；鞣花酸對(duì)照品溶液4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、32 μL注入液相色譜儀。按照“2.1.3液相色譜條件”項(xiàng)下方法測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算3種成分的回歸方程（表2）。

2.1.5精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.1.3液相色譜條件”記錄峰面積，沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.59%、0.85%和0.30%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

大三果供試品溶液制備后分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 進(jìn)行測定，記錄峰面積，沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸色譜峰峰面積的RSD值分別為0.32%，0.73%，0.33%。樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取大三果藥材粉末供試品300 mg，6份，精密稱定，按照“大三果供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備，按照“2.1.3液相色譜條件”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定。沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的平均含量分別為1.69%、0.58%和0.99%，RSD值分別為為0.96%、1.41%和1.37%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn)

2.1.8.1 大三果藥材加樣回收率試驗(yàn)

取大三果供試品150 mg，共6份，精密稱定，分別精密加入對(duì)照品溶液沒食子酸（2.53 mg·mL-1）柯里拉京（0.87 mg·mL-1），鞣花酸（1.5 mg·mL-1）1.0 mL，精密加入50%甲醇57 mL置100 mL三角瓶中，超聲60 min，補(bǔ)足失去重量，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過。精密吸取供試品20 μL，按照“2.1.3液相色譜條件”項(xiàng)下測定峰面積，計(jì)算回收率及RSD值（表3）。

表2 3種成分線性關(guān)系考察

2.1.8.2 鞣質(zhì)部位加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取沒食子酸3.3 mg置100 mL容量瓶中，柯里拉京對(duì)照品4.5 mg置于25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容。精密稱取鞣花酸對(duì)照品3.75 mg置于25 mL容量瓶中，加DMSO溶解，以50%甲醇稀釋并定容。

稱取大三果鞣質(zhì)部位粉末6份，每份約10.5 mg，分別向每一份樣品中精密加入上述對(duì)照品溶液各1.0 mL，50%甲醇定容至10 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取20 μL進(jìn)樣，測定沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸色譜峰峰面積，計(jì)算回收率及RSD值（表4）。

表3 大三果藥材加樣回收率考察結(jié)果

表4 大三果鞣質(zhì)部位加樣回收率考察結(jié)果

表5 不同批次大三果藥材單一成分含量測定結(jié)果（n=3）

表6 不同批次鞣質(zhì)部位3種成分含量測定結(jié)果（n=3）

2.1.9 不同批次大三果藥材和鞣質(zhì)部位中指標(biāo)性成分的含量測定

稱取3個(gè)批次大三果藥材供試品粉末300 mg，精密稱定，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按“2.1.3 高效液相色譜條件”，測定峰面積，計(jì)算含量（表5）。

稱取三個(gè)批次鞣質(zhì)部位粉末約21 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，按“2.1.3高效液相色譜條件”測定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果（表6）。

2.2 總鞣質(zhì)含量測定（2015版中國藥典方法）

2.2.1 溶液制備

磷鉬鎢酸試液：按2015版藥典第四部通則8001試藥部分方法，取鎢酸鈉100 g、鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL磷酸50 mL，加熱回流10小時(shí)，放冷，再加硫酸鋰150 g、水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴（約15 min），冷卻，加水稀釋至1000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色（如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多涂的溴即可）。

29%碳酸鈉溶液：取29 g碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水或10.8 g無水碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水中即得。

對(duì)照品溶液：稱取沒食子酸對(duì)照品約5 mg精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

大三果供試品溶液：取大三果供試品300 mg，精密稱定，置250 mL平底燒瓶中，精密加入60%乙醇150 mL，稱重。50℃溫浸提取12 h，冷卻至室溫，60%乙醇補(bǔ)足原重量，濾過，作為供試品溶液。

大三果鞣質(zhì)部位供試品溶液：取鞣質(zhì)部位粉末約34 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶，60%乙醇溶解，定容，搖勻，備用。

表7 大三果藥材加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8 大三果鞣質(zhì)部位加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

顯色方法：供試液2 mL置25 mL容量瓶中，加入1 mL磷鉬鎢酸試液，再加去離子水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長處測定吸光度。

2.2.2 顯色穩(wěn)定性考察

精密吸取干酪素吸附前后溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”顯色，測定吸光度。每隔10 min測定一次，結(jié)果顯示，靜置顯色20 min后反應(yīng)充分，在20 min到180 min之內(nèi)穩(wěn)定，溶液吸附前后的吸光度RSD值分別為0.4%和0.25%

2.2.3 磷鉬鎢酸比色法測定波長的選擇

分別精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液和大三果樣品干酪素吸附前后溶液各2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.1”顯色，搖勻，暗處放置30 min，400-900 nm范圍內(nèi)掃描測定吸收光譜。顯色后全波長掃描圖，λMAX為760±2 nm。

2.2.4 干酪素用量考察

精密吸取供試品溶液25 mL，分別加入不同量干酪素0.4 g，0.6 g，0.8 g，1 g和1.2 g，每組平行2份，按供試品含量測定法測定含量，結(jié)果表明加入0.8 g干酪素測定鞣質(zhì)的含量較為穩(wěn)定，故選擇干酪素用量為0.8 g。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液（0.0504 mg·mL-1）0.5、1、2、3、4、5 mL，置25 mL容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1ml，再分別加水11.5 mL、11 mL、10 mL、9 mL、8 mL、7 mL，按“2.2.1”顯色，測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：Y=116.53X+0.0309，r=0.9991，沒食子酸在1.008-10.08 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.2.6 精密度考察

精密吸取干酪素吸附前后溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次，RSD分別為0.12%，0.32%，該方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性考察

稱取大三果樣品300 mg 6份，精密稱定，“2.2.10”項(xiàng)方法制備供試品溶液，顯色測定吸光度，計(jì)算鞣質(zhì)成分的含量。RSD為0.51%，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

按2.2.1制備供試品溶液，分別于0，10 min，20 min，30 min，60 min，90 min，120 min精密吸取干酪素吸附前后溶液各2 mL，按“2.2.10”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算鞣質(zhì)類成分的含量。RSD為0.30%，樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

大三果藥材加樣回收率試驗(yàn)：稱取6份大三果藥材粉末（過50目篩），各150 mg，精密稱定，分別精密加入沒食子酸對(duì)照品溶液6 mL（6 mg·mL-1），置250 mL平底燒瓶中，精密加入60%乙醇150 mL，稱重。50℃溫浸提取12 h，冷卻至室溫，用60%乙醇補(bǔ)足原重量，過濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.10”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算鞣質(zhì)含量，計(jì)算平均加樣回收率為（表7）。

表9 大三果藥材和鞣質(zhì)部位鞣質(zhì)含量測定結(jié)果（n=3）

大三果鞣質(zhì)部位加樣回收率試驗(yàn)：稱取6份大三果鞣質(zhì)部位粉末約17 mg，精密稱定。分別精密加入1 mL沒食子酸對(duì)照溶液（9.35 mg·mL-1），置于50 mL容量瓶。60%乙醇溶解后，定容至刻度，按“2.2.10”項(xiàng)下方法測定鞣質(zhì)含量，計(jì)算加樣回收率（表8）。

2.2.10 總鞣質(zhì)含量測定

總酚測定：取3個(gè)批次大三果供試品300 mg，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液。取2 mL，移入25 mL容量瓶，照“2.2.1”顯色方法顯色，測定吸光度。

不被吸附的多酚精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.8 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液。精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按“2.2.1方法顯色，測定吸光度。計(jì)算鞣質(zhì)含量，結(jié)果(表9)。

精密稱取3個(gè)批次大三果鞣質(zhì)部位粉末約34 mg置于50 mL容量瓶。60%乙醇溶解，定容，搖勻，作為測定不被吸附多酚的樣品溶液。按藥材鞣質(zhì)含量測定方法測定總酚和不被吸附多酚，測定吸光度，計(jì)算總鞣質(zhì)含量，結(jié)果（表9）。

3 討論

以各成分含量為指標(biāo)對(duì)供試品的制備方法（提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間等）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示其在50%甲醇中可以完全溶解，樣品出峰佳。對(duì)不同廠家干酪素（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司、北京博奧拓達(dá)科技有限公司及北京索萊寶科技有限公司）空白干擾試驗(yàn)考察結(jié)果表明干酪素水浸出液中，含有干擾試驗(yàn)物質(zhì)；不同生產(chǎn)廠及批號(hào)的干酪素，干擾試驗(yàn)物質(zhì)含量有明顯差異。故“不被吸附多酚”測定中，應(yīng)采用同生產(chǎn)廠家、同批號(hào)的干酪素做空白試驗(yàn)。

本文主要觀察大三果藥材與其鞣質(zhì)部位中3種特征性成分及總鞣質(zhì)含量綜合評(píng)價(jià)大三果的質(zhì)量。方法穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可為大三果的質(zhì)量控制方法研究提供參考。