頂空固相微萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合保留指數(shù)分析杭白菊揮發(fā)性成分

張鵬云，李蓉，李浩洋，龍春霞，楊璐齊，張峰

1(廣東藥科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 中山，528458) 2(中山出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 中山，528400) 3(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 食品安全研究所，北京，100176)

菊花(Chrysanthemiflos)是菊科菊屬宿根性草本植物的干燥頭狀花序，根據(jù)產(chǎn)地和加工方法主要分為“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”和“懷菊”等[1]。2009年衛(wèi)生部把菊花加入“藥食同源”物品名單[2]。杭白菊產(chǎn)于浙江桐鄉(xiāng)，在我國(guó)有悠久的栽培歷史，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)心血管等多方面的生物活性[3]，而揮發(fā)油在抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗炎及促進(jìn)藥物吸收等方面也具有藥理活性[4]，所以菊花中所含的揮發(fā)油與其生理活性密切相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)揮發(fā)油的提取多采用溶劑浸提[5]、水蒸汽蒸餾[6-7]、超臨界CO2流體萃取[8-9]、超聲波輔助萃取[10]、頂空-固相微萃取[11]等方法，再利用氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)檢測(cè)其成分。頂空-固相微萃取技術(shù)(head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME)是近些年發(fā)展起來(lái)的前處理方法，它集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，操作簡(jiǎn)便、使用樣品量少、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，大大加快了分析檢測(cè)的速度[12]。對(duì)揮發(fā)性未知物定性分析時(shí)，通常根據(jù)譜圖檢索的匹配度高低來(lái)確認(rèn)化合物，但是在高匹配化合物較多時(shí)，容易出現(xiàn)定性錯(cuò)誤。而保留指數(shù)也是色譜的一個(gè)定性參數(shù)，在對(duì)同分異構(gòu)體、同系物和結(jié)構(gòu)特征相似的化合物進(jìn)行定性分析時(shí)起到更加重要的作用[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)以杭白菊為研究對(duì)象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)杭白菊的揮發(fā)性成分，對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)檢測(cè)出的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。利用自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS)識(shí)別拆分共流色譜峰，得到更純凈的質(zhì)譜圖，再結(jié)合Kováts保留指數(shù)(retention index，IR)使質(zhì)譜檢索結(jié)果更為準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杭白菊藥材：干花(含水量18.1%)，采自浙江桐鄉(xiāng)；氯化鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C7～C40)，美國(guó)O2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)聯(lián)儀(GC-MS/MS，配電子電離源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、TRIPLUS RSH自動(dòng)進(jìn)樣器、20 mL頂空樣品瓶、固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣手柄，美國(guó)Thermo公司；固相微萃取頭(65 μm PDMS/DVB、85 μm CAR/PDMS、85μm PA、50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件

稱(chēng)取杭白菊碎片0.3 g，置于20 mL頂空瓶中，加入1.0 g NaCl和8 mL蒸餾水，萃取溫度70 ℃，萃取時(shí)間50 min，平衡時(shí)間10 min，解吸時(shí)間5 min，萃取頭為50/30 μm DVB/CAR/PDMS。

1.3.2 GC-MS/MS分析條件

色譜條件：TR-5MS彈性石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，然后以13 ℃/min的速率升溫至100 ℃，以3 ℃/min的速率升溫至110 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min的速率升溫至150 ℃并保持1 min，以2 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持1 min，最后以15 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持2 min；分流比10：1；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣：99.999% 高純度氦氣；流速1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI離子源；離子源溫度：280 ℃；傳輸線(xiàn)溫度：280 ℃；電子轟擊能量：70 eV；掃描方式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z33～350。

1.3.3 保留指數(shù)的測(cè)定

采用相同的氣相色譜條件測(cè)定正構(gòu)烷烴(C7～C40)的保留時(shí)間，自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS)根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，自動(dòng)計(jì)算出杭白菊中各揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)。保留指數(shù)的計(jì)算如公式(1)：

(1)

式中：IR為待測(cè)化合物的保留指數(shù)；n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；Tx為待測(cè)化合物的保留時(shí)間，min；Tn和Tn+1分別為碳原子數(shù)為n、n+1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min，且Tn+1>Tx>Tn。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理由Xcalibur系統(tǒng)軟件完成，應(yīng)用自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS)對(duì)總離子流圖(TIC)自動(dòng)進(jìn)行反卷積處理，所分辨的質(zhì)譜在NIST2.2標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中檢索，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)和文獻(xiàn)已報(bào)道物質(zhì)進(jìn)行核對(duì)，只記錄正匹配和反匹配均大于800的物質(zhì)，并用峰面積歸一化法計(jì)算杭白菊揮發(fā)油成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件的優(yōu)化

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6,15]報(bào)道，杭白菊揮發(fā)油的主要成分是萜烯類(lèi)及其含氧衍生物。因此，本研究用峰面積代表萃取物質(zhì)的量，出峰數(shù)代表萃取物質(zhì)的種類(lèi)，選擇杭白菊揮發(fā)性成分的總峰面積、主峰面積(萜烯類(lèi)及其含氧衍生物)、總峰數(shù)和主峰數(shù)4個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)萃取效果，確定HS-SPME萃取杭白菊揮發(fā)性物質(zhì)的最佳條件。

2.1.1 萃取頭的選擇

稱(chēng)取杭白菊碎片0.3 g，置于20 mL的頂空樣品瓶中，加入8 mL蒸餾水，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為20 min，平衡時(shí)間為10 min，分別考察已老化好的不同萃取頭(85 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm PA)對(duì)杭白菊揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效果，每個(gè)樣品重復(fù)做3次。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 萃取頭對(duì)杭白菊揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Fig.1 Effect of SPME fiber on the extraction of volatile compounds from Chrysanthemum moriflium Ramat

由圖1可以看出，4種萃取頭的萃取效果有明顯差異。當(dāng)用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭時(shí)，總峰面積、總峰數(shù)、主峰面積和主峰數(shù)均為最大；當(dāng)用85 μm PA萃取頭時(shí)，峰面積和出峰數(shù)均為最小。綜合比較，4種萃取頭對(duì)杭白菊揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效果依次為DVB/CAR/PDMS >PDMS/DVB>CAR/PDMS>PA。這是因?yàn)椴煌吞?hào)的萃取頭具有不同極性的固相涂層，根據(jù)相似相溶原理其對(duì)化合物的吸附能力也不同[16]。PDMS/DVB萃取頭適用于醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)等雙極性化合物； CAR/PDMS萃取頭對(duì)于小分子化合物具有較好的吸附能力；DVB/CAR/PDMS萃取頭具有3種涂層，對(duì)非極性和混合極性化合物具有較好的吸附性[17]；PA是極性萃取頭，適用于極性半揮發(fā)性化合物。本研究中杭白菊揮發(fā)油成分較復(fù)雜，混合涂層更加有利于分析，所以本研究選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS。

2.1.2 萃取溫度的選擇

將杭白菊樣品分別在40、50、60、70、80 ℃下，用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取20 min，檢測(cè)揮發(fā)性成分，每個(gè)樣品重復(fù)3次。結(jié)果顯示，隨著萃取溫度的升高，總峰面積和主峰面積都不斷增加；當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，雖然總峰面積略有增加，但是主峰面積卻有所減少(見(jiàn)圖2)。從圖2中還可以看到，總峰數(shù)和主峰數(shù)隨著萃取溫度升高呈先上升后降低趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明在高溫下可能有部分不穩(wěn)定化合物發(fā)生分解。據(jù)EZQUERRO等[18]報(bào)道，萃取溫度對(duì)萃取效果影響較大，當(dāng)溫度升高時(shí)，加快了揮發(fā)性物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)速率，使其在氣相中的含量增大，有利于萃取頭對(duì)目標(biāo)物的吸附。但萃取是一個(gè)放熱過(guò)程，高溫會(huì)降低揮發(fā)性物質(zhì)在萃取頭和樣品之間的分配系數(shù)，使萃取效果降低[19]。而且高溫下，樣品中的不穩(wěn)定物質(zhì)易分解，影響研究結(jié)果。綜合考慮各方面因素，本研究將萃取溫度設(shè)定為70 ℃。

圖2 萃取溫度對(duì)杭白菊揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction of volatile compounds from Chrysanthemum moriflium Ramat

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇

樣品萃取溫度為70 ℃時(shí)，用DVB/CAR/PDMS萃取頭分別萃取20、30、40、50 min，檢測(cè)揮發(fā)性成分，每個(gè)樣品重復(fù)做3次。結(jié)果顯示，當(dāng)萃取時(shí)間在20～40 min之間時(shí)，隨著萃取時(shí)間的增加，總峰面積和主峰面積都逐漸增大，總峰數(shù)和主峰數(shù)變化不明顯。當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)40 min時(shí)，雖然總峰面積和主峰面積變化不大，但是總峰數(shù)變化明顯。當(dāng)萃取時(shí)間為50 min時(shí)，總峰數(shù)和主峰數(shù)都達(dá)到最大值，而萃取時(shí)間為60 min時(shí)，總峰數(shù)和主峰數(shù)卻顯著降低，說(shuō)明有揮發(fā)性成分從萃取頭上解吸出來(lái)(見(jiàn)圖3)。不同萃取時(shí)間對(duì)低分子量揮發(fā)性物質(zhì)和高分子量揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積影響不大。萃取頭吸附揮發(fā)性化合物是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，當(dāng)分析物在萃取頭、頂空和溶液3相中達(dá)到平衡時(shí)的萃取效果最好，所需時(shí)間即為萃取時(shí)間[20]。當(dāng)萃取時(shí)間不足時(shí)，揮發(fā)性化合物不能充分被萃取頭吸附；而萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，某些化合物可能會(huì)從萃取頭上解吸下來(lái)[21]。而且，萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致性質(zhì)不穩(wěn)定，化合物發(fā)生氧化分解等副反應(yīng)[22]。綜合考慮，本方法將萃取時(shí)間設(shè)定為50 min。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)杭白菊揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds from Chrysanthemum moriflium Ramat

2.1.4 氯化鈉(NaCl)的加入量

據(jù)LEE[23]、艾對(duì)[21]等報(bào)道，在樣品中加入氯化鈉可利用鹽析效應(yīng)降低揮發(fā)性成分在水中的溶解度，使揮發(fā)性成分充分逸出，尤其利于小分子化合物揮發(fā)，增加其在頂空瓶上空的濃度，提高萃取靈敏度。但當(dāng)NaCl添加過(guò)量時(shí)，基質(zhì)黏度增加，影響揮發(fā)性成分從水中的逸出，降低萃取效率[24]。實(shí)驗(yàn)將杭白菊樣品分別添加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g NaCl，在70 ℃下用DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取50 min，檢測(cè)揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示，隨著NaCl添加量的增加，總峰面積、總峰數(shù)、主峰面積和主峰數(shù)都呈先上升后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)添加量為1.0 g時(shí)，4個(gè)指標(biāo)都達(dá)到最大值。當(dāng)加鹽量超過(guò)2.5 g時(shí)，總峰面積、主峰面積和主峰數(shù)基本保持不變(見(jiàn)圖4)。說(shuō)明添加少量NaCl有利于揮發(fā)性成分析出，提高萃取效果。因此，本研究選擇加入1.0 g NaCl。

圖4 NaCl添加量對(duì)杭白菊揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Fig.4 Effect of NaCl addition on the extraction of volatile compounds from Chrysanthemum moriflium Ramat

2.1.5 解吸時(shí)間的選擇

萃取頭吸附完成后，要在氣相進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，解吸時(shí)間決定著揮發(fā)性化合物是否能夠完全進(jìn)入氣相色譜柱。當(dāng)解吸時(shí)間不足時(shí)，揮發(fā)性化合物在萃取頭上有殘留，不但影響最終檢測(cè)結(jié)果，還會(huì)影響后續(xù)進(jìn)樣，而當(dāng)解吸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，使萃取頭在高溫下遭到損害，影響其壽命，還會(huì)使部分物質(zhì)發(fā)生熱解反應(yīng)，降低檢測(cè)效率[25-26]。實(shí)驗(yàn)將杭白菊樣品中添加1.0 g NaCl，在70 ℃下，用DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取50 min，然后分別在進(jìn)樣口解吸3、4、5、6 min，檢測(cè)揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示，當(dāng)解吸時(shí)間從3 min增加到4 min時(shí)，總峰面積和主峰面積變化不大，總峰數(shù)和主峰數(shù)都有所增加；而當(dāng)解吸時(shí)間為5 min時(shí)，總峰面積急劇增大，總峰數(shù)、主峰面積和主峰數(shù)均達(dá)到最大值，而解吸時(shí)間為6 min時(shí)，總峰面積又顯著降低，且其余3個(gè)參數(shù)均為最小值(見(jiàn)圖5)。說(shuō)明在5 min時(shí)，已經(jīng)解吸完全。因此，本研究將解吸時(shí)間設(shè)定為5 min。

2.2 實(shí)際樣品分析

稱(chēng)取0.3 g杭白菊碎片于頂空樣品瓶中，加入8 mL蒸餾水，添加1.0 g NaCl，用DVB/CAR/PDMS萃取頭在70 ℃下萃取50 min，解吸5 min來(lái)檢測(cè)杭白菊中的揮發(fā)性成分。通過(guò)氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)分離得到的色譜峰進(jìn)行定性分析，共鑒定出88個(gè)組分，并用峰面積歸一化法得到各組分的相對(duì)含量(表1)，其總離子流圖見(jiàn)圖6。

圖5 解吸時(shí)間對(duì)杭白菊揮發(fā)性成分萃取效果的影響

Fig.5 Effect of desorption time on the extraction of volatile compounds from Chrysanthemum moriflium Ramat

表1 杭白菊的揮發(fā)性化學(xué)成分

續(xù)表1

序號(hào)揮發(fā)性成分匹配度保留指數(shù)正匹配反匹配計(jì)算值參考值相對(duì)含量29壬醛852891110511040.7230苯乙醇945956112011160.0331異佛爾酮85386911271124 0.0632菊油環(huán)酮898899113011230.8533菊烯醇878879113911420.9534反式馬鞭草烯醇859862114911440.2435樟腦934934115111451.1636反式-2-壬烯醛881881115911620.0737順式-菊烯醇948949116611620.4138松香芹酮835892117011640.1639龍腦879894117311830.4140(-)-4-萜品醇926926118411821.6441順-3-己烯基丁酯815818118811870.1242對(duì)甲基苯乙酮892898119311830.5443萘955956119511820.7644α-松油醇887894119811890.35458,9-脫氫百里酚895921122412210.2446順式-香芹醇910910122512290.3247對(duì)枯烯醇926927123312270.2448反-乙酸菊烯酯949951123912390.47492-甲基-3-苯基丙醛898904124812440.0750右旋香芹酮883883125112460.1351順-乙酸菊烯酯948953126612620.6952天竺葵酸856894127012730.2253乙酸龍腦酯933933129212851.9654香芹酚884894129812990.7055β-甲基萘893900130412980.18563,4-二甲基-6-乙基苯酚824845130813050.3457反-乙酸香芹酯928928134113370.1558丁香酚873882136513570.3459順-乙酸香芹酯822894136713620.3160癸酸931933137113730.36612-甲基丁酸苯甲酯866866139213920.9762β-欖香烯927928139813915.9063γ,4-二甲基-4-苯基丁醛804899140914060.5164石竹烯930931142814190.4965(Z)-2-甲基巴豆酸芐酯873896144714460.7366香葉基丙酮895898145414530.2767(E)-β-合歡烯926939145714570.8368倍半香檜烯911923145914640.7169脫氫倍半桉樹(shù)腦8919151472147310.95704.5-二-非手性-馬兜鈴烯913920147714693.0671γ-姜黃烯831832148214800.2872α-姜黃烯911940148614833.4373朱欒倍半萜859871149214922.1774佛術(shù)烯895897149614992.8475順-β-愈創(chuàng)木烯846881150414992.3176β-沒(méi)藥烯841857151215090.2877β-倍半水芹烯904929152715242.2778石竹烯氧化物794818158315811.5879aR-姜黃醇816827158515831.1480十氫二甲基甲乙烯基萘酚800809166516601.6181β-紅沒(méi)藥醇858862167516711.52

續(xù)表1

序號(hào)揮發(fā)性成分匹配度保留指數(shù)正匹配反匹配計(jì)算值參考值相對(duì)含量82(2)-氧化香橙烯8318321679167810.7283α-紅沒(méi)藥醇899942169016845.1784(Z)-Tibetin spiroether859883193319261.0185二十碳烷901901199820000.2086二十一碳烷938943209721004.0387二十二碳烷901903219722000.4788二十三碳烷855855229523003.39

圖6 杭白菊揮發(fā)性成分總離子流圖

Fig.6 Total ion chromatogram of volatile components fromChrysanthemum moriflium Ramat

杭白菊揮發(fā)性成分復(fù)雜，各組分的相對(duì)含量差異較大，主要有烯烴類(lèi)26個(gè)(26.48%)、醇類(lèi)15個(gè)(23.55%)、酮類(lèi)11個(gè)(5.86%)、醛類(lèi)10個(gè)(2.05%)、酯類(lèi)7個(gè)(5.23%)、酚類(lèi)6個(gè)(3.29%)、酸類(lèi)2個(gè)(0.58%)、烷烴類(lèi)4個(gè)(8.09%)、芳香烴類(lèi)3個(gè)(1.24%)。其中含量較高的有脫氫倍半桉樹(shù)腦(10.95%)、(2)-氧化香橙烯(10.72%)、β-欖香烯(5.90%)、α-紅沒(méi)藥醇(5.17%)、α-姜黃烯(3.43%)等。大量研究表明，β-欖香烯具有良好的抗癌活性，對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且引誘細(xì)胞凋亡[27]。除此之外，β-欖香烯還具有抑制新生血管的作用，可應(yīng)用于眼部疾病的治療[28]。α-紅沒(méi)藥醇具有止痛、消炎、抑菌、抗癌、抗突變、抑制遺傳損傷和去黑色素等作用[29-30]。α-姜黃烯有助于內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，而且具有抗病毒、抗腫瘤、抑癌、抑菌等生理活性[31]。另外，還測(cè)得乙酸龍腦酯(1.96%)、樟腦(1.16%)、龍腦(0.41%)，據(jù)報(bào)道，乙酸龍腦酯具有鎮(zhèn)痛抗炎作用[32]；樟腦、龍腦是揮發(fā)油抗菌作用的主要成分[33]。

3 結(jié)論

本研究以浙江桐鄉(xiāng)的杭白菊為研究對(duì)象，建立了HS-SPME-GC-MS/MS結(jié)合保留指數(shù)測(cè)定其中88種揮發(fā)性成分的分析方法，結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性。該方法利用AMDIS的自動(dòng)解卷積功能得到更加純凈的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫(kù)檢索，再參考保留指數(shù)對(duì)組分精準(zhǔn)定性，提高了定性分析的準(zhǔn)確度和效率，使結(jié)果更加可靠，同時(shí)也對(duì)其他樣品的分析具有借鑒作用。