熒光免疫分析法檢測食品中黃曲霉毒素的研究進展

左曉維，雷琳，劉河冰，陶曉奇, 3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京，100095) 3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

20世紀中葉，英國爆發(fā)了大量火雞突然死亡事件，研究者們在喂養(yǎng)的飼料中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)。AFT是食品感染了寄生曲霉或黃曲霉后在高溫高濕(溫度為25～30 ℃，水分>15%)的環(huán)境中，產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物。目前已發(fā)現(xiàn)的AFT有20多種，主要以4種天然毒素(B1、B2、G1、G2)和2種代謝產(chǎn)物(M1和M2)的形式存在。AFM1多發(fā)現(xiàn)于牛奶中，是因為牛食用了含有AFB1的飼料，在體內(nèi)酶的催化下生成了羥基化代謝物。AFT是由1個毒性結(jié)構(gòu)(二呋喃環(huán))和1個與致癌有關(guān)的結(jié)構(gòu)(氧雜萘鄰?fù)?組成的共同結(jié)構(gòu)[1]，表現(xiàn)出極強的毒性和明顯的致癌作用。早在1993年，國際腫瘤研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)就將AFT認定為I類致癌物[2]。其中危害最大的AFB1屬于特劇毒物質(zhì)，致癌能力也最強，其次是AFG1和AFM1，其余的毒性較弱。

黃曲霉毒素毒性大，污染范圍廣，在糧食及糧食制品、油脂、乳及乳制品、調(diào)味品、堅果、茶葉等100多種食品中均有發(fā)現(xiàn)[3]。為此，各國相繼出臺了嚴苛的法律法規(guī)，制定了食品中AFT含量的限量標準，如表1所示。

準確、快速、便捷地檢測出食品中的AFT，是科學(xué)有效地處理已污染食品的必要前提。目前，檢測AFT的方法分為化學(xué)分析法、生物鑒定法、儀器分析法和免疫分析法等?；瘜W(xué)分析法中的薄層層析法曾于1990年被美國分析化學(xué)家協(xié)會定為檢測AFT的標準方法[7]，但它是1種半定量的檢測方法，靈敏度低，需與標準品直接接觸，危險性高，其應(yīng)用在近年來受到限制。生物鑒定法為定性分析，通常只作為佐證[8]。儀器分析法是國標檢測方法之一，結(jié)果準確可靠、重復(fù)性好，但儀器購買和維護昂貴，前處理復(fù)雜，分析時間長，不適合現(xiàn)場大量樣本的快速檢測，難以在基層大范圍推廣[9]。中國地域?qū)拸V、人口眾多、食品需求量大，但食品的貯存條件、加工水平、檢測技術(shù)相對落后，開發(fā)特異性強、靈敏度高、簡便快捷、經(jīng)濟安全的免疫學(xué)方法是解決食品中AFT污染問題的突破口之一。目前，用于AFT檢測的免疫學(xué)方法有：酶聯(lián)免疫吸附法[10]、膠體金免疫層析技術(shù)[10]、熒光免疫分析法[11]、化學(xué)發(fā)光免疫分析法[12]、免疫傳感器等[13]。

1941年，CONS和KAPLAN用熒光素標記抗體，來定位組織中的抗原，第一次提出了熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)的概念[14]。FIA在高特異性免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光技術(shù)的靈敏性，具有靈敏度高、準確性好，易實現(xiàn)高通量、自動化檢測等優(yōu)勢，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展。近幾年，隨著人們對食品安全的重視程度不斷加深，F(xiàn)IA逐漸被應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域。由于AFT在食品中存在的廣泛性和極大的危害性，成為研究者們關(guān)注的熱點，并依據(jù)FIA原理研發(fā)出各種新型的檢測技術(shù)。本文綜述了4類主要的熒光標記物，并重點闡述了5類熒光免疫分析法的原理及其在食品中AFT檢測方面的研究進展，以期為食品安全監(jiān)控和更深入的科學(xué)研究提供有益參考。

表1 中國、美國和歐盟對食品中黃曲霉毒素的限量標準

1 熒光標記物

某些物質(zhì)能夠在紫外光的激發(fā)下輻射出各種顏色、不同強度的可見光，這種光線會隨著激發(fā)光的消失，存在短于1 s的時間后消失，輻射光被稱作熒光[15]，熒光產(chǎn)生的本質(zhì)是隨著電子從高能態(tài)躍遷回基態(tài)，能量以光的形式被釋放出來。將這些物質(zhì)作為熒光標記物應(yīng)用到FIA中，根據(jù)檢測原理和檢測形式的不同，通過功能性基團或親和素-生物素，將熒光標記物與抗原、抗體或核酸等生物識別分子偶聯(lián)，形成熒光標記復(fù)合物，作為熒光探針，具有示蹤和反映免疫反應(yīng)進程的特性。目前在AFT檢測中常用的熒光標記物有熒光素、量子點(quantum dots，QDs)、上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)和稀土離子螯合物(表2)。

表2 熒光標記物的主要特點

1.1 熒光素

熒光素是一類具有熒光特性的化合物，在紫外光的照射下，比其他顏色標記物的溶劑變色效應(yīng)更顯著。熒光素中含有能與多肽共軛連接的基團，標記蛋白質(zhì)、核酸、多肽、小分子待測物等各種生物識別物質(zhì)，用作熒光探針。目前，F(xiàn)IA中使用的熒光素主要有兩類，一類是需要經(jīng)酶催化的熒光前體物質(zhì)，包括4-甲基傘酮磷酸鹽(堿性磷酸酶的底物)、4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷(β-半乳糖苷酶的底物)和對羥基苯乙酸(辣根過氧化物酶的底物)等。另一類是可被紫外光直接激發(fā)的熒光物質(zhì)，如異硫氰酸熒光素、有機熒光染料(羅丹明類、香豆素類)、β-藻紅蛋白、傘形酮衍生物和德克薩斯紅等。

大部分熒光素光化學(xué)穩(wěn)定性差，光照時易分解，易被光漂白，高濃度下易淬滅[16]，故近幾年在檢測食品中AFT的研究中常用二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙烯等材料包裹熒光素，制成球形的、表面多孔的熒光微球，再在微球表面修飾用于標記的羧基或氨基等基團。熒光微球的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、發(fā)光效率更高，檢測的準確性和靈敏度更高[17-19]。

1.2 量子點

QDs是準零維的半導(dǎo)體納米顆粒，目前研究較多的是由II-VI族元素(CdSe、CdTe、CdS、ZnSe、ZnS等)和III-V族元素(InP、InAs等)組成的[20]，也有少數(shù)是由IV-VI族元素(PbS、PbSe等)組成的核殼式結(jié)構(gòu)。QDs是理想的熒光標記物，它的發(fā)射光譜窄，激發(fā)范圍寬，熒光量子產(chǎn)率高，熒光發(fā)射可測量，穩(wěn)定性好，信噪比高，能夠準確地檢測和量化其熒光強度[21]，熒光壽命長于背景熒光的壽命(1～10 ns)，已被廣泛用于提高FIA的檢測靈敏度。不同尺寸的QDs可實現(xiàn)單激發(fā)、多波長輻射，形成彩色QDs，在標記多種真菌毒素的抗體后，可以實現(xiàn)同步檢測食品中的AFT和其他毒素，能夠有效提高檢測效率[22]。但QDs易在光氧化作用下釋放出有害的重金屬離子，在某些緩沖液或極端化學(xué)環(huán)境中發(fā)生熒光淬滅[23]。在AFT的檢測中，研究者們通過將數(shù)以萬計的QDs包裹于二氧化硅等無機材料中，制成量子點微球(quantum dot beads，QBs)，改善了QDs的光性質(zhì)，提高了其穩(wěn)定性和安全性[24]。

1.3 上轉(zhuǎn)換納米粒子

上轉(zhuǎn)換發(fā)光也稱逆Stokes發(fā)光，與熒光素、QDs和背景物質(zhì)的熒光激發(fā)和發(fā)射相反，是將長波長的激發(fā)光(近紅外光)轉(zhuǎn)換成短波長的發(fā)射光。其特殊的發(fā)光機理使UCNPs成為一種優(yōu)越的生物標記材料，具有可用于復(fù)雜生物樣本；不易被光漂白；檢測的背景值低；對生物組織穿透性好(>10 mm)、無損傷；改變摻雜元素的種類和比例，實現(xiàn)單激發(fā)、多譜帶發(fā)射，可用于多組分同時檢測等優(yōu)點[25-26]。目前研究較熱的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料有NaYF4∶Yb/Er(NaYF4是目前上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率最高的基質(zhì)材料，Er是激活劑，Yb是敏化劑)、Y2O3∶Yb/Er和LaF3∶Yb/Ho，是檢測食品中AFT的一種新型熒光標記物[27]。

1.4 稀土離子螯合物

稀土離子是指從元素鑭到元素镥的15種元素，也稱鑭系離子，其中應(yīng)用最廣泛的是銪(Eu3+)。當其與高吸光系數(shù)的配體結(jié)合形成螯合物時，本身發(fā)光能力較差的稀土離子，可發(fā)出高強度的特征熒光[28]。稀土離子螯合物的Stokes位移較大，可避免激發(fā)光的干擾；熒光壽命較長，通過延遲檢測時間，能最大程度地降低本底信號；體積小且不影響被標記物的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，可多位點標記，實現(xiàn)對多種目標物質(zhì)的同時檢測[29-30]。也可用溶脹法或包覆法將稀土離子螯合物制備成時間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microspheres，TRFM)，使每個生物分子上偶聯(lián)的稀土離子的平均數(shù)增加，且不需要加入增強液即可直接進行熒光測定[31-32]。因其獨具時間分辨和波長分辨的特點，稀土離子螯合物已成為檢測食品中AFT的新技術(shù)研發(fā)熱點。

2 熒光免疫分析法在黃曲霉毒素檢測中的應(yīng)用

熒光免疫分析法的原理是當制備好的熒光探針在發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)后，其熒光強度或與待測物質(zhì)的量相關(guān)，或因大小、距離的變化而發(fā)生改變。根據(jù)檢測原理的不同，熒光免疫分析法分為熒光免疫吸附法(fluorescence-linked immunosorbent assay，F(xiàn)LISA)、熒光免疫層析法(fluorescent immunochromatographic assay，F(xiàn)ICA)、熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PI)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析(flurescence resonance energy transfer immunoassay，F(xiàn)RET)和時間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)(表3)。其中FPIA和FRET是均相反應(yīng)體系，TRFIA既適用于均相體系，也可用于非均相體系。FIA的形式多樣、靈敏度高、高通量、可定量，豐富了食品檢測技術(shù)的多樣性，已逐漸成為檢測食品中AFT的重要方法。

表3 檢測食品中AFT的熒光免疫分析法比較

2.1 熒光免疫吸附法

FLISA采用免疫吸附的檢測形式，用熒光標記物取代酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性核素等傳統(tǒng)的標記物。經(jīng)過包被、封閉、反復(fù)洗滌等操作，直接激發(fā)熒光標記物，熒光信號強度與待測物的量成正比或反比。該方法比酶聯(lián)免疫吸附法的檢測靈敏度高，可滿足檢測食品中微量或超微量AFT的需求，是目前使用最廣泛的技術(shù)。

ZHANG等[33]成功地將碲化鎘QDs標記到AFB1的單克隆抗體上，建立了直接競爭FLISA，該方法的檢測限為0.016 ng/mL，在空白花生基質(zhì)中添加AFB1標準品，回收率為85%～117%。BELOGLAZOVA等[34]用脂質(zhì)體包裹水不溶性的QDs，使其在水性介質(zhì)中仍保持較高的發(fā)光產(chǎn)率，用作熒光標記物標記AFB1和AFM1的抗原，與微孔中預(yù)包被的AFB1抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，檢測牛奶中AFM1的檢測限為0.002 5 μg/kg。FLISA通常使用96孔微孔板作為固相載體，搭配彩色QDs，更易于實現(xiàn)多組分的檢測，BELOGLAZOVA等[22]又利用彩色QDs開發(fā)了2種不同形式的多重FLISA，可同時篩選谷類中的多種真菌毒素。在第1種形式中，同一平板的不同微孔可以同時檢測多種毒素，稱做單一分析物的多重檢測，第2種形式叫做雙分析物的多重檢測，用2種顏色的QDs分別標記玉米赤霉烯酮和AFB1，再將其2種不同的特異性抗體固定在同一個微孔中。這2種不同的模式豐富了檢測形式的多樣性，為食品樣本中有毒有害物質(zhì)的高通量篩選提供了更多可能。

磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)具有易于分離的特點，替代微孔板成為更優(yōu)的固相載體。WU等[26]以人工抗原修飾的MNPs作為免疫傳感探針，以抗體偶聯(lián)的多色UCNPs作為熒光探針，建立了同時檢測玉米中AFB1和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)2種毒素的新型FLISA。這種方法結(jié)合了UCNPs多組分檢測的特性和MNPs的磁性分離效應(yīng)，在保證高靈敏度的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了AFB1和OTA的多組分同時檢測，節(jié)約了一半的檢測時間，且AFB1和OTA的檢測限均低至0.01 μg/kg。ATANASOVA等[35]創(chuàng)新地用熒光素標記由AFM1轉(zhuǎn)化成的AFM1-肟，與原料乳中的AFM1競爭結(jié)合MNPs上偶聯(lián)的抗體，在磁性分離去除免疫復(fù)合物后，通過檢測上清液的熒光強度進行定量分析，檢測限為2.9 pg/mL，定量范圍為3.0～100 pg/mL。并對比發(fā)現(xiàn)靈敏度在分析不同品種的原料乳時存在差異，樣本為高脂肪濃度的羊乳時最低。

FLISA在AFT檢測方面發(fā)展了多種多樣的形式，利用QDs和UCNPs可實現(xiàn)單組分和多組分的檢測，結(jié)合MNPs既可以作為固相載體增加抗原抗體反應(yīng)效率，也可以作為免疫傳感探針的特性，提高了食品中AFT檢測的靈敏度和自動化程度。

2.2 熒光免疫層析法

傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)以膠體金為標記物，通過條帶顯色或讀取灰度值對目標物進行定性分析或半定量檢測，但其靈敏度較差，難以準確定量。FICA既保留了傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術(shù)可用于現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點，又具有FIA高靈敏度的特點，是一種新型的膜檢測技術(shù)，能夠快速、簡便、準確測量食品中的AFT。

REN等[24]采用微乳液技術(shù)制備QBs，標記AFB1的單克隆抗體，用制備的熒光定量試紙條檢測玉米樣本中的AFB1，檢測限為0.42 pg/mL，使用QBs所能達到的靈敏度是使用QDs的39倍。ZHANG等[17]選用羧酸鹽修飾的聚苯乙烯熒光微球作為熒光標記物。在最優(yōu)條件下，牛奶樣本中AFM1檢測限為4.4 ng/L，整個檢測過程可在30 min內(nèi)完成。劉曉等[36]基于UCNPs開發(fā)了檢測奶粉和牛奶中AFM1的快速FICA，能夠在20 min內(nèi)完成定性及定量檢測，奶粉和牛奶中的檢測限分別為0.1、0.3 μg/kg，檢測限和檢測時間均優(yōu)于ZHANG等[17]的報道，但不同的原料特性和檢測條件會影響比較的結(jié)果。WU等[18]在相同條件下對比了基于熒光微球和QDs 2種熒光標記物的FICA，檢測牛奶中的AFM1，使用熒光微球時的檢測限更低(42.3 pg/mL)，準確性更好，精確度更高，方法的可靠性強；使用量子點時總的檢測時間更短(15 min)，消耗的抗體量更少(0.01 μg)，該研究方法可作為篩選適當熒光標記物的重要參考。FICA除用于檢測常見的糧食、牛奶等樣本外，也可用于深色食品的檢測。LIU等[19]首次用基于熒光微球的FICA定性檢測醬油中AFB1，10%甲醇溶液稀釋醬油樣品后直接用于檢測，省略了提取程序，大幅度降低前處理的復(fù)雜性。此方法定性分析AFB1的檢測限為2.5 μg/L，低于國標規(guī)定的最高限量5 μg/L。

FICA的建立和其多樣性的發(fā)展依賴于多種熒光標記物的合成，尤其是近幾年使用較多的各種熒光材料微球的制備。在食品中AFT的檢測方面，應(yīng)用最多的標記物是QBs和UCNPs，借助這2種熒光材料的特點，多組分同時分析成為檢測食品中AFT和其他有毒有害物質(zhì)的發(fā)展趨勢。

2.3 熒光偏振免疫分析

FPIA是一種均相的、快速的、高通量的免疫學(xué)檢測方法。其檢測原理是當熒光探針發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后，分子質(zhì)量變大，自旋速度變慢，偏振熒光強度增強。整個過程無需分離和洗滌等步驟，經(jīng)過短暫的溫育后便可直接測量。FPIA主要用于小分子物質(zhì)的測定，在檢測AFT的報道中，常采取競爭的反應(yīng)模式，偶聯(lián)有熒光標記物的AFT與樣本中的AFT競爭結(jié)合特異性抗體，偏振熒光強度與樣本中AFT的量呈反比[37]。

NASIR等[38]報道了一種基于FPIA的便攜、快速的分析儀，檢測玉米、高粱、花生油、花生醬等11種真實樣本中的AFB1，與高效液相色譜的相關(guān)性為0.97。但該方法不適用于檢測添加回收的爆米花樣本，回收率較低。SHENG等[39]也建立了FPIA檢測AFB1的方法，檢測限為13.12 ng/mL。AFB1、AFB2、AFM1、AFM2、AFG1和AFG2與制備的AFB1的單克隆抗體的交叉反應(yīng)率分別為100%、65.7%、111.4%、2%、143%和23.5%，表明該方法可以用于除AFG2和AFM2之外的AF總量的檢測。在1個微孔板上分析96個樣品所需的總時間少于5 min，有效地減少了檢測時間。ZHANG等[40]開發(fā)的雙波長FPIA，也能夠檢測玉米中AFT的總量，同時還能檢測6種玉米赤霉烯酮類似物的總量，用不同的熒光素標記AFB1和玉米赤霉烯酮，然后與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合。玉米樣本中AF總量和6種玉米赤霉烯酮類似物的總量的檢測限分別為4.98 μg/kg和11.03 μg/kg，平均回收率為78.6%～103.6%，變異系數(shù)在19.2%以下。整個檢測過程，包括樣品制備，總時長不超過30 min，很大程度上提高了檢測的效率。FPIA也適用于特殊樣本的檢測，BELOGLAZOVA等[41]利用FPIA快速篩選啤酒中的AFB1。因為啤酒樣品的基質(zhì)特殊，在分析之前需用含有1% PEG 6000的硼酸鹽緩沖溶液稀釋，再通過裝有NH2-衍生二氧化硅的凈化柱，AFB1的檢測限為1 ng/mL。但此種前處理方法只適用于貯藏啤酒，不適用于麥芽啤酒和黑啤。這是為數(shù)不多的使用FIA檢測啤酒樣本的研究，為之后檢測各種食品基質(zhì)中的AFT提供參考。

FPIA在檢測食品中AFT方面的報道較少，主要是因為其相對于其他方法的靈敏度和準確性低，不能滿足實際AFT檢測中的低限量要求。但雙波長FPIA檢測技術(shù)的報道，為實現(xiàn)多組分同時分析提供了一定的技術(shù)支持。

2.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析

1948年，科學(xué)家F?RSTER首先提出了FRET的理論，當2個熒光基團足夠靠近時(1～10 nm)，通過雙偶極相互作用，激發(fā)態(tài)的供體分子和基態(tài)的受體分子之間發(fā)生非輻射性的能量共振轉(zhuǎn)移，供體分子躍遷到基態(tài)而不激發(fā)熒光，受體分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再躍遷回基態(tài)的同時發(fā)射熒光或發(fā)生熒光淬滅。FRET的效率主要由供體與受體的距離、光譜的重疊度和偶極間的相對方向決定[42]。FRET具有均相反應(yīng)高效、簡便、快速，無需額外的洗滌和分離步驟等優(yōu)點。在AFB1的檢測中，需要根據(jù)不同的熒光光譜特征，選擇合適的能量供受體，QDs因為其吸收光譜寬，通常被用作受體。

ZEKAVATI等[43]分別用CdTe QDs標記抗體，熒光素羅丹明123標記抗原，作為能量供受體，利用CdTe量子點的熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長為505 nm)與羅丹明123的熒光激發(fā)光譜(最大激發(fā)波長為510 nm)有重疊，建立FRET檢測AFB1，檢測限可以達到2×10-11mol/L。

ASWANI等[44]用Cd/Se QDs標記核酸適配體作為能量供體，同時采用新型的高效淬滅劑-氧化石墨烯(graphene oxide，GO)作為能量受體。利用核酸適配體分別與GO和抗原之間的π～π堆積作用和特異性反應(yīng)，縮小或拉大供受體之間的距離，使QDs的熒光發(fā)生淬滅或恢復(fù)的變化。在玉米和小麥中AFB1的檢測限為4 μg/mL，線性范圍為2～200 μg/mL。SABET等[45]同樣也用核酸適配體代替抗體，創(chuàng)新地將免疫學(xué)方法與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種基于FRET的免疫傳感器，檢測花生和大米中AFB1的含量。在空白樣本中，QDs標記的核酸適配體會吸附到膠體金納米顆粒(Au nanoparticles，AuNPs)的表面，導(dǎo)致QDs的熒光淬滅。當樣本中含有AFB1時，特異性的核酸適配體結(jié)合AFB1，拉大了與AuNPs之間的距離，熒光恢復(fù)。該方法的檢測限為3.4 nmol/L，與常見的干擾物質(zhì)，如AFB2、AFG2和AFM2，均未有顯著的交叉反應(yīng)。XU等[46]在FRET免疫傳感器基礎(chǔ)上，使用2種輻射波長的綠色QDs和紅色QDs，分別標記AFB1的多價半抗原和單克隆抗體，作為供體和受體，考察不同標記比率對FRET效率的影響。在pH 7.4，含10 mmol/L NaCl和10%體積分數(shù)甲醇的磷酸鹽緩沖液作為最優(yōu)工作液，檢測時間為加樣后20 min的條件下，通過分析傅里葉紅外光譜、熒光光譜和透射電子顯微鏡的圖像，得到熒光信號強度與AFB1濃度之間的依賴關(guān)系，定量檢測大米中AFB1的含量。該檢測方法的靈敏度高，檢測限為0.13 pmol/L，定量檢測的線性范圍為0.19～16 pmol/L。

FRET的建立除了可以使用熒光標記物，也可利用AFB1抗體的內(nèi)熒光淬滅現(xiàn)象，AFB1的抗體中含有的內(nèi)在熒光物質(zhì)-色氨酸殘基，在與抗原結(jié)合時會發(fā)生熒光淬滅。LI等[47]巧妙地利用了這一原理，建立了大麥樣品中AFB1的定量檢測方法，檢測限為0.85 ng/mL。進一步研究表明，結(jié)構(gòu)完整的抗體的輻射光只有部分被淬滅，改用抗體的Fab片段作為受體，其熒光幾乎被完全淬滅，檢測限為0.09 ng/mL，提升9.4倍。利用改造后的抗體作為淬滅材料是提高檢測方法靈敏度的一種新思路。

檢測小分子物質(zhì)的競爭性免疫分析方法，信號強度和分析物濃度呈負相關(guān)，這限制了競爭法的靈敏度。基于FRET的熒光淬滅法使信號強度和分析物濃度呈正相關(guān)，在一定程度上提高了檢測的靈敏度。大量的研究將FRET和免疫傳感器技術(shù)結(jié)合，推動了AFT和其他有毒有害物質(zhì)的檢測向微量化、高通量和自動化的方向發(fā)展。

2.5 時間分辨熒光免疫分析

1983年，SOINI和KOJOLA等首次用稀土離子螯合物作為標記示蹤物，結(jié)合時間分辨熒光測量技術(shù)，開創(chuàng)了一種新的非放射性微量分析技術(shù)-TRFIA[48]。其中，銪(Eu3+)、釤(Sm3+)和鈰(Ce3+)及其螯合物是最常使用的熒光標記物。相比于其他的FIA，借助稀土離子螯合物熒光壽命長的特點，在每個激發(fā)光脈沖后延遲測量時間，待短壽命的熒光淬滅后再選擇性測定稀土離子螯合物的熒光，以達到消除背景熒光干擾的目的，實現(xiàn)時間分辨和波長分辨，具有更高的靈敏度和更低的干擾性，一直是研究的熱點。在AFT等小分子檢測領(lǐng)域常用間接競爭、直接競爭模式。

不同的鑭系元素有著激發(fā)波長相同，發(fā)射波長不同的特點，如Eu3+和Sm3+的激發(fā)光的波長均為340 nm，發(fā)射光的波長分別為613 nm和610 nm。利用這一特點，HUANG等[30]報道了一種用于同時定量測定AFB1和OTA的雙標記TRFIA。首先用2種抗原包被微孔板，隨后添加標準品和樣品，最后加入已稀釋的抗體、Eu3+和Sm3+分別標記的山羊抗鼠IgG，讀數(shù)前加入增強液。結(jié)果表明，AFB1的檢測限為0.02 μg/L，定量范圍為0.021～100 μg/L，AFB1和OTA的檢測互不干擾，一次操作可同時得到兩種目標物質(zhì)的檢測結(jié)果，節(jié)省了近一倍的檢測時間。雙標記TRFIA和單標記TRFIA與高效液相色譜的相關(guān)系數(shù)分別0.972和0.981，結(jié)果一致。

TRFIA的檢測形式多樣，既可建立上述的時間分辨免疫吸附法，也可利用TRFM建立時間分辨熒光免疫層析法(chromatographic time-resolved fluoroimmunoassay，CTRFIA)。張兆威等[31]成功利用乳膠包裹Eu3+的TRFM，檢測花生、稻米、植物油中AFB1，檢測限是0.3 μg/kg，線性范圍分別是0.8～25.0 μg/kg、0.8～15.0 μg/kg和0.8～30.0 μg/kg。同年，TANG等[32]也利用TRFM建立了一種高靈敏度的CTRFIA，無需任何樣本前處理過程，可在6 min內(nèi)準確檢測出原料乳中AFM1的含量。使用TRFM標記AFM1的單克隆抗體2C9，在競爭模式下，該方法的檢測限為0.03 ng/mL，靈敏度比之前報道的膠體金免疫層析法提高了10倍。一方面是因為2C9和AFM1之間的親和力較高，另一方面因為每個直徑190 nm的TRFM中包裹了約20億個EU3+,且能標記更多的抗體，提高了免疫測定探針的熒光強度。TRFM的成功制備和在側(cè)向流層析體系的迅速應(yīng)用，豐富了AFT的檢測形式，降低了檢測時間，提高了檢測效率。

TRFIA同樣也可以與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，2015年，ZHANG等[49]又開發(fā)了一種超靈敏的、便攜式的CTRFIA的免疫傳感器，用于現(xiàn)場快速測定食品中的AFB1。在時間分辨模式下，沒有激發(fā)光源引起的信號干擾，具有放大的正向信號和較低的信噪比。其檢測范圍寬，為0.20～60 μg/kg，檢測限低，從0.06 μg/kg到0.12 μg/kg，不同食品基質(zhì)中(花生、玉米、醬油、植物油)的回收率為80.5%～116.7%。

TRFIA兼具時間分辨和波長分辨的特點，可以有效地減少樣本的背景干擾，大幅度提高檢測的靈敏度。近幾年，為適應(yīng)定量、便捷和快速檢測的要求，建立了真菌毒素檢測的時間分辨多組分分析法，并且相繼開發(fā)了檢測AFT的CTRFIA和時間分辨免疫傳感器等方法，為現(xiàn)場大通量快速篩選食品中的AFT打下了堅定的技術(shù)基礎(chǔ)。

3 展望

自放射免疫分析技術(shù)之后涌現(xiàn)了很多非放射性的免疫分析方法，用于食品中黃曲霉毒素的檢測，其中熒光免疫分析法的形式多種多樣，靈敏度高，操作簡便，高通量，準確性高，符合現(xiàn)代檢測領(lǐng)域快速、定量和便捷的發(fā)展趨勢。熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性差是熒光檢測技術(shù)發(fā)展的瓶頸。用有機材料將數(shù)以萬計的熒光物質(zhì)包裹成納米微球，有增加穩(wěn)定性，減少非特異性吸附，提高熒光強度的作用，可以有效增加熒光檢測方法的靈敏度和適應(yīng)性。多組分物質(zhì)的同時檢測是檢測技術(shù)新的發(fā)展趨勢。熒光免疫分析法在多組分析方面有著無可比擬的優(yōu)勢，除稀土離子螯合物可實現(xiàn)多位點標記之外，彩色量子點和上轉(zhuǎn)換納米顆粒均有著單激發(fā)、多譜帶發(fā)射的優(yōu)點，在多組分分析中占據(jù)著重要地位。除此之外，食品中AFT的熒光免疫分析還可以從以下3個方面進一步研究和發(fā)展。

3.1 熒光標記物

熒光標記物是熒光免疫分析法的核心之一，其特性與檢測的靈敏性和穩(wěn)定性直接相關(guān)。在檢測食品中AFT的進一步研究中，一方面需優(yōu)化現(xiàn)有熒光標記物的制備工藝。增強熒光的穩(wěn)定性，提高對基質(zhì)的耐受性，防止發(fā)生熒光淬滅，例如鑭系離子(除Eu3+之外)的穩(wěn)定性仍不能達到準確定量檢測的要求；提高熒光強度，放大熒光信號；減少熒光標記物與其他物質(zhì)的非特異性結(jié)合。另一方面是開發(fā)新材料，例如使用近紅外的熒光材料，可最大限度避免背景熒光物質(zhì)的干擾。研發(fā)多種顏色的熒光標記物，不僅易于區(qū)分辨別，更有利于實現(xiàn)多組分的同時檢測。

3.2 新型分子識別物

抗體是熒光免疫分析法的另一個核心。雖然抗體的靈敏度高、特異性強，但傳統(tǒng)地通過ELISA篩選出的抗體適應(yīng)相差，并不適用于所有的熒光免疫分析法，用待建方法篩選抗體，成本較高。因此，可使用基因重組抗體、多肽片段、分子印記聚合物等具有抗體功能的生物識別大分子代替抗體應(yīng)用于檢測食品中的AFT。基因重組抗體的制備是利用分子生物學(xué)去除或減少抗體的無關(guān)和產(chǎn)生副作用的結(jié)構(gòu)，其制備周期短，分子量小，可操作性強。已證明羊駝基因重組抗體的使用能夠提高檢測玉米和玉米制品中的AFB1和ZEN的靈敏度[50]，分別比使用單克隆抗體的靈敏度高18.3倍和20.3倍。

3.3 熒光免疫分析法的優(yōu)化

可從樣本的前處理、新型熒光讀取儀和與其他技術(shù)聯(lián)合使用等方面優(yōu)化熒光免疫分析法。用免疫親和柱或磁珠對樣本的待測物質(zhì)進行富集，去除基質(zhì)干擾，使后續(xù)的熒光免疫反應(yīng)具有高度特異性。研發(fā)信噪比高、讀取穩(wěn)定、可設(shè)置讀取范圍和數(shù)量、可攜帶的新型的熒光讀取儀，搭配內(nèi)置的標準曲線和云儲存空間，實現(xiàn)多組分檢測和現(xiàn)場的快速高通量定量檢測。將熒光免疫分析法與其他技術(shù)，如信號循環(huán)放大技術(shù)、芯片技術(shù)相結(jié)合，進一步提高檢測的靈敏度和方法的集成化。

本文綜述了4類熒光標記物的特點和5種熒光免疫分析法的檢測原理，重點闡述了熒光免疫分析法應(yīng)用于檢測食品中黃曲霉素時的多樣化發(fā)展現(xiàn)狀。研發(fā)基質(zhì)耐受性強、熒光強度高、可用于多組分檢測的熒光標記物，方法適用性更強的新型分子識別物替代抗體和樣本前處理方法、新儀器、技術(shù)聯(lián)用將是熒光免疫分析法的3個發(fā)展趨勢，以期為食品中AFT等毒素快速檢測的未來研究提供參考。