siRNA干擾VRK1表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞BANF1蛋白表達(dá)及增殖遷移能力的抑制作用

耿杰，李雨晴，李晉，王婷婷，裴露，劉紅春,3

0 引言

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居世界惡性腫瘤第六位，主要以食管鱗癌為主[1-3]。治療方法為以手術(shù)為主的綜合治療，但患者五年生存率較低。抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是提高食管癌生存率的關(guān)鍵[4-7]。牛痘病毒相關(guān)性激酶1（vaccinia virus associated kinase 1, VRK1）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)有絲分裂相關(guān)激酶家族成員之一，可以通過磷酸化修飾的形式參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)[8]。研究表明，VRK1表達(dá)對(duì)正常組織或惡性組織中細(xì)胞系的增殖和存活具有顯著調(diào)控作用[9-11]。BAF蛋白由屏障自整合因子1（barrier integration factor1,BANF1）基因編碼，是有絲分裂核重組、調(diào)節(jié)反轉(zhuǎn)錄病毒的整合前復(fù)合體穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能的必需蛋白質(zhì)[12-13]。已有研究表明BANF1是VRK1蛋白激酶的一種具有高度親和力的底物，VRK1可以介導(dǎo)BAF蛋白的磷酸化[14]?；谶@些研究，我們認(rèn)為VRK1和BANF1二者可在癌細(xì)胞的生理學(xué)過程中發(fā)揮重要的協(xié)同作用。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，VRK1及BANF1在食管鱗癌組織中表達(dá)升高，其高表達(dá)在食管鱗狀細(xì)胞癌的病程進(jìn)展中具有正相關(guān)作用，并且與不良預(yù)后相關(guān)[15-16]。為驗(yàn)證該作用，我們進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞株EC109和EC1，利用小干擾RNA下調(diào)VRK1的表達(dá)，探究干擾后食管癌細(xì)胞BANF1表達(dá)及食管鱗癌細(xì)胞的增殖及遷移能力的改變，為食管癌靶向治療提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 食管癌EC109、EC1細(xì)胞系購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（不含抗生素）RPMI1640培養(yǎng)基（上海生工生物工程有限公司）中，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA（上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行消化并傳代。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS）、Lipofectamine2000均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；設(shè)計(jì)合成的siRNA176、siRNA571、siRNA862及對(duì)照siRNA購(gòu)自上海Gene Pharma公司；兔抗人牛痘病毒相關(guān)激酶1抗體（一抗）、兔抗人障礙自整合蛋白BAF抗體（一抗）、羊抗兔辣根酶標(biāo)記IgG（二抗）和流式相關(guān)抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司，UVP凝膠電泳拍攝及分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GENE公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司 ；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管鱗癌EC109、EC1細(xì)胞，按4×105個(gè)每孔接種于六孔板，5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細(xì)胞融合度約70%時(shí)，按產(chǎn)品使用手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中實(shí)驗(yàn)組滴加siRNA-Lipofectamine2000混合液500 μl（siRNA濃度為20 μmol/L，siRNA571合成序列為正義鏈5’-GCAGCUAAGCUUAAGAAUUTT-3’；反義鏈5’-AAUUCUUAAGCUUAGCUGCTT-3’），陰性對(duì)照組則使用無義siRNA （正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作為空白對(duì)照組，8字法混勻后放回培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染5 h后，更換為帶血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染完成。

1.2.2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾后食管癌細(xì)胞VRK1和BANF1的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染完成24 h后，收集各組EC109和EC1細(xì)胞系，用冷卻的PBS緩沖液沖洗3次，各孔加含有PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液200 μl，再收集細(xì)胞勻漿粉碎，4℃ 13 000 r/min離心15 min，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制膠后每孔上樣30 ng進(jìn)行免疫電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，與一抗孵育（1：1 000稀釋4℃孵育過夜），洗滌（TBST洗滌3次，每次10 min）后，與二抗孵育（1：4 000稀釋，室溫孵育1 h），洗滌后進(jìn)行顯影，經(jīng)UVP凝膠成像掃描分析儀成像拍照，用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量（目的蛋白的表達(dá)量與內(nèi)參照GAPDH表達(dá)量的比值）。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾后食管癌細(xì)胞增殖能力的改變 轉(zhuǎn)染12 h后，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋后，每孔取500個(gè)細(xì)胞，鋪至96孔板中，每組設(shè)三個(gè)平行孔，周圍空白孔，加入PBS防止蒸發(fā)。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)間隔12 h，測(cè)試三天，CCK-8檢測(cè)前，加入混合好的110 μl CCK-8混合液（100 μl新鮮培養(yǎng)基+10 μl CCK-8原液）。孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值（OD450）。增殖抑制率（%）=（OD空白對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD空白組×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA干擾對(duì)食管癌細(xì)胞周期的影響 轉(zhuǎn)染12 h后，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取1 ml細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)1×106/ml），2 000 r/min離心5 min后，使用PBS沖洗細(xì)胞兩次，除去上清液后，加入500 μl 70%的冰乙醇，4℃固定細(xì)胞過夜。染色前，1 000 r/min離心5 min去除上清注液后，加入PBS沖洗細(xì)胞一次，加入100 μl RNaseA（1 mg/ml）和400 μl PI（500 μg/ml）37℃水浴30 min。上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm處的紅色熒光。

1.2.5 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾后食管癌細(xì)胞遷移能力的改變 待轉(zhuǎn)染完成后，當(dāng)EC109和EC1細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組細(xì)胞密度達(dá)到90%左右，鋪至24孔板中。細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM沖懸細(xì)胞 ，使細(xì)胞密度達(dá)到1×104個(gè)每毫升，每室加入300 μl DMEM培養(yǎng)基（即3 000個(gè)細(xì)胞）。 下室加入含血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl。置培養(yǎng)箱內(nèi)，12 h后檢測(cè)細(xì)胞遷移。使用棉棒將上室細(xì)胞擦除，將小室泡在結(jié)晶紫染液中，待細(xì)胞染色即可觀察。顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)小室的細(xì)胞遷移數(shù)，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白免疫印跡篩選siRNA-VRK1干擾效果及檢測(cè)干擾前后BANF1蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)通過不同siRNA干擾食管癌細(xì)胞VRK1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA571干擾效果最佳，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用siRNA571。轉(zhuǎn)染siRNA-VRK1后，EC109和EC1兩種細(xì)胞系的空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組VRK1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA干擾組VRK1蛋白的表達(dá)顯著低于空白組及陰性對(duì)照組，分別下降62.40%和52.14%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.23,P＜0.05），見圖1。干擾VRK1表達(dá)后進(jìn)一步分析BANF1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示EC109和EC1兩種細(xì)胞系的空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組BANF1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA干擾組的BANF1蛋白表達(dá)較空白組及陰性對(duì)照組減低，分別下降24.51%和52.87%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.13,P＜0.05），見圖2。

圖1 Western blot法檢測(cè)兩種食管癌細(xì)胞株VRK1的表達(dá)Figure1 VRK1 expression in esophageal cancer EC109 and EC1 cell lines measured by Western blot

圖2 Western blot法檢測(cè)兩種食管癌細(xì)胞株BANF1的表達(dá)Figure2 BANF1 expression in esophageal cancer EC109 and EC1 cell lines measured by Western blot

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

結(jié)果顯示，siRNA571干擾食管癌EC109和EC1細(xì)胞后，細(xì)胞增殖較陰性對(duì)照組低，均為轉(zhuǎn)染12 h后細(xì)胞增殖開始受到抑制，36 h抑制率最高，分別為19.41%（t=4.231,P＜0.05）和20.10%（t=5.131,P＜0.05），見圖3。

圖3 EC109和EC1細(xì)胞siRNA571和siNC組細(xì)胞增殖曲線Figure3 Growth curves of EC109 and EC1 cells in siNC and siRNA571 groups

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

EC109細(xì)胞系siRNA571干擾組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞峰值均較陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005、P=0.001），siRNA571干擾組S期細(xì)胞峰相對(duì)于陰性對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。EC1細(xì)胞系也出現(xiàn)相似的結(jié)果，siRNA571干擾組G2/M期細(xì)胞峰值相比于陰性對(duì)照組減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022），siRNA571干擾組S期細(xì)胞峰值相對(duì)于陰性對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023），見圖4。

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)EC109和EC1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組細(xì)胞周期分布情況Figure4 Cell cycle distribution of EC109 and EC1 cells in experimental group and negative control group detected by flow cytometry

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低VRK1后，BANF1表達(dá)下調(diào)，兩種食管鱗癌細(xì)胞系遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)均下降，見圖5，EC1細(xì)胞系中siRNA干擾組細(xì)胞遷移數(shù)目（36.30±8.08）明顯低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組（F=122.451,P＜0.01）。EC109細(xì)胞系中siRNA干擾組細(xì)胞遷移數(shù)（38.20±1.43）亦明顯低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組（F=114.430,P＜0.01），見圖6。

3 討論

近年來，周期蛋白依賴性激酶家族（cyclindependent kinases, CDK）和其他相關(guān)有絲分裂激酶已經(jīng)成為腫瘤學(xué)分子診斷水平上新興的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，牛痘病毒相關(guān)性激酶家族在腫瘤相關(guān)疾病研究中開始被逐漸提及[17]。VRK1是細(xì)胞周期蛋白D1的一個(gè)早期應(yīng)答基因，其編碼的牛痘病毒相關(guān)激酶-1是牛痘病毒相關(guān)性激酶家族的一員[18]，在人體組織中廣泛表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，并在活躍性強(qiáng)的分裂期細(xì)胞，如睪丸細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、胎肝細(xì)胞和癌細(xì)胞[9,19]中表達(dá)水平升高，主要通過磷酸化修飾的方式參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)，如染色體凝聚、核膜的分解和重組以及DNA損傷反應(yīng)等[20]，并可以促進(jìn)具有轉(zhuǎn)錄活性的p53蛋白分子的穩(wěn)定性及核內(nèi)積累，在體外條件下也可通過磷酸化作用減少p53分子泛素化[10]。因此，該基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能。

圖5 EC109和EC1細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h后遷移能力的改變 (×100)Figure5 Migration abilities of EC109 and EC1 cells after transfection for 12 h (×100)

目前研究發(fā)現(xiàn)，VRK1有可能在多種腫瘤如乳腺癌[21]、肝細(xì)胞癌[22]和結(jié)直腸癌[23]中發(fā)揮著促癌作用，Lee等[11]和Huang等[22]研究發(fā)現(xiàn)VRK1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)，并與美國(guó)腫瘤研究聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）肝癌分級(jí)和不良預(yù)后密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，VRK1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中過表達(dá)，其高表達(dá)在食管鱗狀細(xì)胞癌的病程進(jìn)展中可能具有正相關(guān)作用，并且與不良預(yù)后相關(guān)[15-16,24]。本研究進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞EC109和EC1，利用siRNA干擾VRK1表達(dá)，Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)下調(diào)VRK1表達(dá)，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VRK1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞增殖能力降低，在VRK1 siRNA轉(zhuǎn)染12 h后，細(xì)胞增殖能力開始降低，轉(zhuǎn)染36 h增殖抑制率最高，達(dá)20%左右。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，EC109和EC1細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞阻滯在S期即DNA合成期。VRK1不僅可以影響細(xì)胞增殖周期，其還可對(duì)細(xì)胞遷移進(jìn)行調(diào)控，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示干擾VRK1表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力降低，這些細(xì)胞功能的改變可能與VRK1參與細(xì)胞生理過程有關(guān)。細(xì)胞異常增殖與遷移是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志，VRK1下調(diào)能夠降低癌細(xì)胞增殖及遷移能力證實(shí)了其在食管癌病程進(jìn)展中具有一定的促進(jìn)作用，降低VRK1表達(dá)可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖遷移，有望為食管癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

圖6 EC109和EC1各組細(xì)胞遷移能力的比較Figure6 Comparison of migration abilities of EC109 and EC1 cells among different groups

有研究證明，屏障自身整合因子（BAF蛋白）是VRK1蛋白激酶的高親和力底物[14]，BAF蛋白是由BANF1基因編碼，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，可以在有絲分裂期間與染色體產(chǎn)生特異性結(jié)合作用，具有濃縮DNA和組裝高級(jí)核蛋白復(fù)合物的能力，是有絲分裂核重組、調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的組裝和定位、調(diào)節(jié)反轉(zhuǎn)錄病毒的整合前復(fù)合體穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的必需細(xì)胞蛋白質(zhì)。我們前期研究[15-16]發(fā)現(xiàn)BANF1在食管鱗癌組織中的表達(dá)也明顯高于癌旁組織，本研究提出干擾VRK1表達(dá)后，食管癌細(xì)胞增殖減低可能是由于BANF1蛋白表達(dá)下調(diào)造成的。Western blot檢測(cè)干擾VRK1蛋白表達(dá)后BANF1蛋白表達(dá)降低，同時(shí)流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期在S期即DNA合成期受到較多的阻滯作用，M期分裂期細(xì)胞比例下降，以上結(jié)果證實(shí)，BAF蛋白可能通過調(diào)節(jié)DNA與核周蛋白的結(jié)合以及紡錘絲的組裝和定位，使細(xì)胞有絲分裂過程異常進(jìn)行，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲低VRK1的表達(dá)可以降低細(xì)胞BANF1蛋白的表達(dá)，初步證實(shí)了兩者在食管癌細(xì)胞生理過程中的協(xié)同作用。

我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VRK1和BANF1均在食管鱗癌組織中過表達(dá)，并與分化程度和TNM分期有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在細(xì)胞水平證實(shí)了VRK1和BANF1通路參與促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和遷移的進(jìn)程，敲低VRK1的表達(dá)可以降低細(xì)胞BANF1蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞較多阻滯在S期，同時(shí)影響細(xì)胞的遷移能力?；谝陨辖Y(jié)論我們可以將VRK1可以作為癌癥治療的一個(gè)合適靶點(diǎn)。但由于VRK1是有絲分裂相關(guān)激酶家族的一員，是正常細(xì)胞增殖分化過程所必須的，以VRK1作為臨床試驗(yàn)的藥物靶標(biāo)是否會(huì)破壞體細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)，從而阻礙正常細(xì)胞的增殖周期，這些問題仍需進(jìn)一步研究。另外敲低VRK1表達(dá)后，BANF1表達(dá)降低也初步表明VRK1作為BANF1的上游基因，在食管癌的病理生理過程中，參與調(diào)控了BANF1的表達(dá)合成，兩者之間的通路在食管癌的發(fā)病和進(jìn)展過程中起促進(jìn)作用，但兩者的相互作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。