異黏蛋白調(diào)控鼻咽癌細胞增殖及紫杉醇耐藥的研究

余長云，劉勇，曹華

0 引言

鼻咽癌為東南亞及我國南部地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，每年約有80 000新發(fā)病例[1]。放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，對早期患者效果較好，五年生存率可達90%以上；但對于晚期患者效果并不理想。目前認為，放化療結(jié)合的綜合治療是鼻咽癌的重要治療手段，化療在中晚期或復發(fā)及轉(zhuǎn)移患者的治療中起著非常重要的作用[2-4]。然而化療耐藥的產(chǎn)生嚴重制約了鼻咽癌患者的最終治療效果。因此，闡明鼻咽癌化療耐藥的分子機制，并采取有效措施預防和抑制鼻咽癌化療耐藥，對提高患者的總體治療效果具有重要意義。

異黏蛋白（metadherin, MTDH）作為癌基因在乳腺癌、肝癌和肺癌等多種實體瘤中異常表達，并促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MTDH在頭頸部鱗狀細胞癌（簡稱頭頸鱗癌）組織中高表達，能通過誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和腫瘤血管新生促進頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移，與患者預后顯著負相關(guān)[6-7]。然而，目前有關(guān)MTDH在頭頸鱗癌化療耐藥中的作用報道尚少。因此，本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上探討MTDH對鼻咽癌細胞增殖及紫杉醇耐藥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌細胞株5-8F、HNE-1均購自北納創(chuàng)聯(lián)生物公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，特級胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%胰蛋白酶消化液（含乙二胺四乙酸）、雙抗（青霉素-鏈霉素）均購自美國Gibco公司，細胞計數(shù)（CCK-8）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，MTDH過表達慢病毒顆粒、MTDH沉默慢病毒顆粒及對照慢病毒顆粒均由河南九睿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，嘌呤霉素購自美國Santa Cruz公司，Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人MTDH多克隆抗體購自美國Proteintech Group公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞5-8F、HNE-1均在37?C、5%CO2及飽和濕度條件下，用含有10%特級胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，常規(guī)0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實驗均選用處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的5-8F、HNE-1細胞按約2×105個/孔接種于6孔板中，用無抗生素細胞培基培養(yǎng)24 h，使轉(zhuǎn)染時細胞融合率達80%～85%。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進行，感染復數(shù)MOI=10。轉(zhuǎn)染后24 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入4 μg/ml的嘌呤霉素進行篩選2周后，Western blot檢測MTDH過表達和沉默效果，再進行后續(xù)實驗。后續(xù)實驗分為親本細胞組、MTDH過表達組、MTDH沉默組及陰性對照組。

1.2.3 Western blot提取各組細胞總蛋白 采用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid, BCA）測定細胞總蛋白濃度。取50 μg總蛋白進行變性處理，進行10%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳。蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h。加入兔抗人MTDH多克隆抗體（1：800）、小鼠抗人β-actin抗體（1：1000）于4?C下孵育過夜。洗膜后，于辣根過氧化抗兔二抗（1：3000）、辣根過氧化抗小鼠二抗（1：1000）室溫下孵育1 h。洗膜后，經(jīng)化學發(fā)光劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照并分析。實驗重復三次。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力 分別將5-8F、HNE-1 MTDH過表達細胞、MTDH沉默細胞及陰性對照細胞按1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設(shè)5個復孔，共培養(yǎng)5天。分別于培養(yǎng)第1d、2d、3d、4d和5d時向每孔加入10 μl CCK-8測定液，2 h后用酶標儀測定450 nm波長吸光度值（OD）。實驗重復三次。

1.2.5 流式細胞實驗檢測細胞周期及凋亡 分別將5-8F、HNE-1 MTDH過表達細胞、MTDH沉默細胞及陰性對照細胞接種于六孔板中，每孔約1×106個細胞，每組設(shè)3個復孔，培養(yǎng)24 h。胰酶消化制成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，以PBS溶液重懸、1 000 r/min離心5 min、去上清液，重復洗滌細胞2次后棄去上清液，每組細胞加入1 ml 70%乙醇重懸固定細胞，18 h后行流式細胞術(shù)檢測細胞周期。同法，收集各組細胞進行Annexin V-FITC和PI雙染色，1 h內(nèi)行流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率。實驗均重復三次。

1.2.6 CCK-8法檢測紫杉醇對5-8F、HNE-1細胞的30%抑制濃度（IC30）、50%抑制濃度（IC50）、70%抑制濃度（IC70） 常規(guī)培養(yǎng)細胞處于對數(shù)生長期時消化傳代，細胞計數(shù)并調(diào)整5-8F細胞數(shù)為1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml；過夜貼壁后向各孔中加入不同濃度紫杉醇100 ml（紫杉醇終濃度分別為0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5和25 nmol/L），同時設(shè)置只含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)3個復孔；培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8測定液，2 h后用酶標儀測定450 nm波長吸光度值（OD）。計算各濃度的抑制率，并算出紫杉醇對5-8F細胞的IC30、IC50、IC70濃度。生長抑制率=（OD對照組平均值-OD實驗組平均值）/（OD對照組平均值-OD空白組平均值）×100%。紫杉醇對HNE-1細胞的IC30、IC50、IC70檢測時加入的紫杉醇終濃度分別為0、0.1、1、5、10、20和50 nmol/L，其余步驟同5-8F細胞。實驗均重復三次。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞生存率 分別將5-8F MTDH過表達細胞及陰性對照細胞、HNE-1 MTDH過表達細胞及陰性對照細胞1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設(shè)5個復孔；過夜貼壁后向各孔中加入含IC50、IC70濃度紫杉醇的細胞培養(yǎng)基100 ml，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。分別將5-8F MTDH沉默細胞及陰性對照細胞、HNE-1 MTDH沉默細胞及陰性對照細胞1×104個每毫升接種于96孔板，每孔100 ml，每組設(shè)5個復孔；過夜貼壁后向各孔中加入含IC30、IC50濃度紫杉醇的細胞培養(yǎng)基100 ml，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。實驗重復三次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用多樣本均數(shù)的方差分析進行多個樣本均數(shù)的比較，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗，采用獨立樣本t檢驗進行兩樣本均數(shù)的比較。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 建立穩(wěn)定高表達和沉默MTDH的鼻咽癌細胞株

Western blot結(jié)果顯示5-8F、HNE-1過表達組細胞MTDH表達量分別是對照組的4.6倍、2.77倍；1號干擾序列在5-8F、HNE-1中沉默效率均達80%以上，見圖1～2。以上結(jié)果表明，MTDH穩(wěn)定高表達和沉默的細胞株構(gòu)建成功，可用于下一步實驗研究。

2.2 MTDH對鼻咽癌細胞生長增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，MTDH過表達后5-8F、HNE-1細胞在培養(yǎng)3、4、5 d時的OD值均大于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；然而，沉默MTDH表達后，5-8F、HNE-1細胞在培養(yǎng)3、4、5 d時的OD值均小于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。這些表明，MTDH上調(diào)可促進鼻咽癌細胞生長增殖，MTDH下調(diào)抑制鼻咽癌細胞生長增殖。

2.3 MTDH對鼻咽癌細胞周期的影響

圖1 轉(zhuǎn)染MTDH cDNA和MTDH-shRNA后5-8F細胞中MTDH蛋白相對表達情況Figure1 The expression of MTDH protein in 5-8F cells transfected with MTDH cDNA and MTDH-shRNA

圖2 轉(zhuǎn)染MTDH cDNA和MTDH-shRNA后HNE-1細胞中MTDH蛋白表達情況Figure2 The expression of MTDH protein in HNE-1 cells transfected with MTDH cDNA and MTDH-shRNA

流式細胞實驗結(jié)果顯示：MTDH沉默組的G1期細胞比例（5-8F：（55.813±2.521）%，HNE-1：（55.117±1.495）%）較對照組（5-8F：（37.330±0.325）%, HNE-1：（48.487±0.781）%）明顯增加，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-18.694,P=0.000；HNE-1：t=-6.807,P=0.002）；而MTDH沉默組S期細胞比例（5-8F：（34.753±2.626）%，HNE-1：（23.543±2.251）%）與對照組（5-8F：（35.127±2.072）%，HNE-1：（20.683±2.634）%）比較差異無統(tǒng)計學意義（5-8F：t=0.193,P=0.856;HNE-1：t=-1.430,P=0.226）；MTDH沉默組G2/M期細胞比例（5-8F：（8.727±4.873）%, HNE-1：（23.277±4.093）%）較對照細胞組（5-8F：（25.630±1.470）%, HNE-1：（31.060±2.037）%）明顯減少，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=5.752,P=0.005; HNE-1：t=2.949,P=0.042），見圖4。

圖3 MTDH對5-8F細胞(A)、HNE-1細胞(B)增殖能力的影響Figure3 Effects of MTDH on proliferation of 5-8F(A) and HNE-1(B) cells

圖4 MTDH對5-8F、HNE-1細胞周期的影響Figure4 Effect of MTDH on cell cycle of 5-8F and HNE-1 cells

2.4 MTDH對鼻咽癌細胞凋亡的影響

流式細胞實驗結(jié)果顯示，MTDH過表達組細胞凋亡率（5-8F： （1.243±0.266）%, HNE-1： （5.590±0.387）%）較對照組細胞凋亡率（5-8F：（3.293±1.243）%, HNE-1： （6.617±0.431）%）降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=4.118,P=0.015；HNE-1：t=3.067,P=0.037），見圖5A。MTDH沉默組細胞凋亡率（5-8F：（6.737±0.735）%, HNE-1：（11.910±1.102）%）較對照組細胞凋亡率（5-8F：（3.293±1.243）%, HNE-1：（6.617±0.431）%）增高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-4.005,P=0.016; HNE-1：t=-7.744,P=0.001），見圖5B。

圖5 MTDH過表達(A)及沉默(B)后對5-8F、HNE-1細胞凋亡的影響Figure5 Effects of MTDH overexpression(A) and silence(B) on apoptosis of 5-8F and HNE-1 cells

2.5 上調(diào)MTDH降低鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感度

根據(jù)CCK-8結(jié)果確定，紫杉醇對5-8F的IC30、IC50、IC70分別為2.947、5.875、8.802 nmol/L，紫杉醇對HNE-1的IC30、IC50、IC70分別為2.077、6.768、22.052 nmol/L。分別用IC50、IC70濃度的紫杉醇作用于MTDH過表達鼻咽癌細胞及對照細胞，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。結(jié)果顯示：MTDH表達上調(diào)之后，鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感度降低，在IC70濃度下，MTDH過表達組細胞的生存率（5-8F： 41.05±5.47, HNE-1：44.37±2.07）高于對照組細胞（5-8F： 28.94±3.24, HNE-1： 30.16±3.56），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-4.261,P=0.003; HNE-1：t=-7.727,P=0.000）；在IC50濃度下，MTDH過表達組細胞的生存率（5-8F： 61.36±6.51, HNE-1：64.17±3.26）亦高于對照組細胞（5-8F： 50.16±2.39, HNE-1： 54.98±3.15），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=-3.610，P=0.007; HNE-1：t=-4.538,P=0.002），見圖6。

圖6 上調(diào)MTDH降低鼻咽癌細胞5-8F(A)、HNE-1(B)對紫杉醇敏感度Figure6 MTDH overexpression decreased sensitivity of NPC 5-8F(A) and HNE-1(B) cells to paclitaxel

2.6 下調(diào)MTDH提高鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感度

分別用IC30、IC50濃度的紫杉醇作用于MTDH沉默組鼻咽癌細胞及對照細胞，48 h后CCK-8法檢測細胞生存率。結(jié)果顯示：沉默MTDH表達之后，鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感度升高，在IC50濃度下，MTDH沉默組細胞的生存率（5-8F： 30.70±1.73, HNE-1： 44.99±3.16）低于對照組細胞（5-8F：50.16±2.39, HNE-1： 54.98±3.15），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=14.757,P=0.000; HNE-1：t=5.008,P=0.001）；在IC30濃度下，MTDH沉默組細胞的生存率（5-8F： 62.56±5.14, HNE-1： 63.36±3.51）亦低于對照組細胞（5-8F： 73.78±2.76,HNE-1： 72.95±2.94），兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（5-8F：t=4.297,P=0.003; HNE-1：t=-4.681,P=0.002），見圖7。

3 討論

紫杉醇作為鼻咽癌化療的一線藥物，其臨床效果得到一致認可。然而，細胞耐藥性的產(chǎn)生嚴重制約了其最終治療效果。因此，闡明紫杉醇耐藥性產(chǎn)生的分子機制，尋找紫杉醇耐藥密切相關(guān)的分子標志物和干預靶點，有望改善鼻咽癌患者的臨床治療效果。近年來，盡管紫杉醇耐藥的相關(guān)性研究取得一定進展，但其具體分子機制目前仍不十分清楚，尚需從新的角度進行深入探討。

圖7 下調(diào)MTDH提高鼻咽癌細胞5-8F(A)、HNE-1(B)對紫杉醇敏感度Figure7 MTDH silence sensitized NPC 5-8F(A) and HNE-1(B) cells to paclitaxel

MTDH是2002年新發(fā)現(xiàn)的一個癌基因，在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中異常表達，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MTDH在乳腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中高表達，并促進化療耐藥性產(chǎn)生[8-10]。然而，MTDH在鼻咽癌化療耐藥中的作用目前尚不明確。李果等研究發(fā)現(xiàn)MTDH蛋白在鼻咽癌細胞和組織中的表達較鼻咽部黏膜均顯著上調(diào)，其表達水平與患者血清EB病毒滴度的高低、T分級、臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)[11]。本研究中，我們通過基因功能獲得或缺失研究表明，MTDH過表達可促進鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥性；而沉默MTDH表達可抑制鼻咽癌細胞生長增殖，并增強鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感度。宋振川等在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MTDH可通過調(diào)控凋亡等促進乳腺癌細胞紫杉醇耐藥[12]。Zhang等在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，以MTDH為靶點的基因疫苗能有效抑制小鼠前列腺癌的生長轉(zhuǎn)移并增強化療藥物紫杉醇的敏感度[13]。本研究結(jié)果與宋振川及Zhang等的研究結(jié)果一致，表明MTDH對紫杉醇化療耐藥具有促進作用。然而，MTDH如何調(diào)控鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生有待進一步研究。

研究表明，MTDH可通過促增殖和抗凋亡效應(yīng)調(diào)控腫瘤細胞的增殖[14]。本研究中細胞周期分析結(jié)果顯示，沉默MTDH表達后鼻咽癌細胞G1期比例增加，S期細胞無顯著變化，G2/M期細胞比例降低，提示MTDH沉默后可能通過將細胞阻滯在G1期來抑制細胞增殖。此外，流式細胞分析還顯示，MTDH過表達組細胞凋亡率降低，MTDH沉默組細胞凋亡率增加。這些結(jié)果與MTDH在卵巢癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中的研究一致[15-16]，提示MTDH可能通過調(diào)控細胞周期和凋亡進而影響鼻咽癌細胞增殖。EMT是具有極性的上皮細胞向具有活動能力的間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的過程，是一類基本形態(tài)和基因表型變化，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、放化療抵抗等生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用[17]。我們前期研究證實，MTDH可通過誘導EMT形成，進而促進頭頸鱗癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[6]。此外，在另一項研究中我們發(fā)現(xiàn)，MTDH在酸性微環(huán)境調(diào)控鼻咽癌細胞紫杉醇耐藥中發(fā)揮重要作用[18]。這些提示我們，MTDH可能通過EMT調(diào)控鼻咽癌細胞細胞紫杉醇耐藥，這也是我們后續(xù)研究的方向之一。

綜上所述，本研究在體外水平闡明MTDH可促進鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生。該研究結(jié)果進一步豐富了MTDH在腫瘤中的生物功能，為今后利用MTDH蛋白作為鼻咽癌紫杉醇耐藥的分子靶點提供了新的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。然而，MTDH調(diào)控鼻咽癌細胞生長增殖及紫杉醇耐藥的具體分子機制仍需深入探討，且需從體內(nèi)實驗對現(xiàn)有體外實驗結(jié)果進行佐證。