脫脂椰蓉可溶性膳食纖維制備工藝及單糖組成和理化特性分析

杜曉靜，白新鵬，姜澤放，高 巍，張芳芳

（海南大學(xué)食品學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

脫脂椰蓉為全脂椰蓉榨油后剩余部分，含有大量纖維素，是制備膳食纖維的良好原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前脫脂椰蓉被當(dāng)作廢棄物或直接用作動(dòng)物飼料，既浪費(fèi)資源，又造成環(huán)境污染，有效成分也未能被充分利用[1]。目前關(guān)于椰子油、椰子蛋白的研究較多，但關(guān)于脫脂椰蓉膳食纖維的報(bào)道還較少[2]。膳食纖維是指不被人體消化的多糖類碳水化合物和木質(zhì)素的總稱，被公認(rèn)為第七大營(yíng)養(yǎng)素[3-4]?，F(xiàn)代社會(huì)對(duì)飲食的要求越來越精細(xì)化，對(duì)膳食纖維攝入量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，膳食纖維攝入量不足會(huì)嚴(yán)重影響人類健康[5]。膳食纖維根據(jù)溶解性分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fi ber，IDF），二者的功效作用不同[6]。SDF能在結(jié)腸中幾乎被徹底水解，能夠促進(jìn)腸道益生菌生長(zhǎng)，具有阻礙脂質(zhì)運(yùn)輸、預(yù)防心血管疾病以及清除自由基的作用[7-9]；IDF具有能夠促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、控制體重、緩解便秘、防治癌癥等作用[10-12]。因此SDF含量是衡量膳食纖維品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[13]。

目前對(duì)脫脂椰蓉膳食纖維的研究程度并不深，相關(guān)報(bào)道較少，脫脂椰蓉膳食纖維提取方法有酶法[1]、化學(xué)法[2]和發(fā)酵法[14]。但目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)椰蓉膳食纖維的提取多采用化學(xué)法，雖然該法工藝簡(jiǎn)單、成本低，但膳食纖維得率低、容易造成化學(xué)殘留；酶法可獲得高純度產(chǎn)品，但酶制劑成分較高。因此本研究以脫脂椰蓉為原料，采用酶-化學(xué)法提取椰蓉SDF，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件，確定SDF最佳的提取工藝，對(duì)提取的SDF進(jìn)行單糖成分分析和結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)分析其理化性質(zhì)，為脫脂椰蓉粕的綜合開發(fā)利用提供可靠的科學(xué)依據(jù)和廣闊的市場(chǎng)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂椰蓉粕 ?？谑写蟀卓到♂t(yī)療有限公司；95%乙醇溶液 西隴科學(xué)股份公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純） 廣州試劑化學(xué)廠；α-淀粉酶（3 700 U/g）、糖化酶（100 000 U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AII研磨機(jī) 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；CU-420恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；EL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；PHS-3D酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂椰蓉預(yù)處理

把脫脂椰蓉粕凍干后粉碎，過80 目篩，密封備用；酶解：取脫脂椰蓉粉樣品2 g，添加40 mL蒸餾水，調(diào)pH 6.5，加入混合酶（α-淀粉酶-糖化酶1∶1，m/m）60 ℃水浴邊酶解邊攪拌；滅酶：100 ℃水浴滅酶10 min；堿解：滅酶后，待溫度降至60 ℃加入適量的NaOH溶液進(jìn)行堿解，并不斷攪拌；醇沉：將提取液于5 000 r/min離心10 min，取上清液旋蒸后用4 倍體積的95%乙醇溶液進(jìn)行醇沉過夜，干燥稱質(zhì)量即為SDF[9,15]。椰蓉SDF得率計(jì)算見式（1）：

式中：m1為提取SDF質(zhì)量；m為樣品質(zhì)量。

1.3.2 影響椰蓉SDF得率的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2 g椰蓉粉，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，固定混合酶添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）0.4%、酶解時(shí)間60 min、堿液（NaOH溶液）質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、堿解時(shí)間30 min條件，分別設(shè)置混合酶添加量為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%；酶解時(shí)間30、40、50、60、70 min，1 mol/L的堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、3%、4%、5%、6%；堿解時(shí)間10、20、30、40、50 min。抽濾，取上清液，濃縮后加入4 倍體積的95%乙醇溶液醇沉過夜，離心取沉淀物，凍干稱量，計(jì)算SDF得率，考察混合酶添加量、酶解時(shí)間、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、堿解時(shí)間對(duì)SDF得率的影響。

1.3.3 Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)

采用Design-Expert軟件中的Box-Behnken建立數(shù)學(xué)模型，以混合酶添加量、酶解時(shí)間、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿解時(shí)間4 個(gè)單因素為自變量，椰蓉SDF得率Y為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.4 脫脂椰蓉SDF單糖組成的測(cè)定

1.3.4.1 單糖衍生化

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生法測(cè)定脫脂椰蓉SDF單糖組成。分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液于5 mL具塞試管中，加400 μL PMP-甲醇溶液，渦旋混勻；于70 ℃水浴反應(yīng)2 h，取出放置冷卻至室溫；加400 μL 0.3 mol/L鹽酸溶液中和（pH 6～7）；加水200 μL，再加等體積的氯仿，渦旋混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，萃取2 次。將水相用0.45 μm微孔膜（水系）過濾后供高效液相色譜進(jìn)樣分析。

1.3.4.2 樣品水解液的制備

稱取10～20 mg多糖樣品于10 mL鉗口瓶中，加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetate，TFA），充N2封管，110 ℃烘箱中水解6 h；冷卻后打開蓋，取2 mL加入1 mL甲醇后，在70 ℃水浴下用N2吹干，如此重復(fù)2 次，以去除TFA；加入2 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘?jiān)瑸闃悠范嗵撬庖骸?/p>

1.3.4.3 高效液相色譜檢測(cè)條件

儀器型號(hào)：Agilent 1100，配二極管陣列檢測(cè)器；色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：100 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.4）；流動(dòng)相B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。洗脫程序：0～10 min，85%～83% A；10～30 min，83%～80% A；30～35 min，80%～60% A；35～36 min，60%～85% A；36～40 min，85% A。

1.3.5 紅外光譜分析

精確稱取干燥的脫脂椰蓉粉和椰蓉SDF樣品各1 mL于瑪瑙研缽中，加入100 mg干燥KBr晶體，在紅外燈照射下研磨至極細(xì)混勻，用壓片機(jī)壓片，制成一定直徑和厚度的透明片，于紅外分光光度計(jì)400～4 000 cm－1紅外區(qū)掃描，測(cè)定紅外光譜曲線。

1.3.6 原料椰蓉和脫脂椰蓉膳食纖維理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.6.1 持水力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g椰蓉SDF加50 mL去離子水，25 ℃攪拌2 h，3 000 r/min離心30 min，將上清液倒出，稱質(zhì)量得到吸水后的樣品，按式（2）計(jì)算持水力[16]：

1.3.6.2 膨脹性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g椰蓉SDF置于25 mL量筒中，加入15 mL蒸餾水，振蕩搖勻后浸泡24 h測(cè)定體積，按式（3）計(jì)算膨脹性[17]：

1.3.6.3 持油力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g椰蓉SDF加入15 g花生油，混勻后于常溫下靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，取沉淀物（吸油后的樣品），稱質(zhì)量，按式（4）計(jì)算持油力[18]：

1.3.7 椰蓉SDF純度的測(cè)定

按照AOAC 993.19[17]，利用凱式定氮法進(jìn)行蛋白質(zhì)殘留檢測(cè)，對(duì)適量樣品進(jìn)行灰分測(cè)定，并計(jì)算其純度[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂椰蓉粉成分分析

表2 脫脂椰蓉粉主要成分含量Table2 Main components of defatted coconut flour%

由表2可知，脫脂椰蓉粉中含13.5%的蛋白質(zhì)，粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63.25%，膳食纖維相對(duì)含量為70.14%，可知脫脂椰蓉粉具有豐富的纖維組分。如將其充分利用，不僅可以充分利用脫脂椰蓉資源，而且可為脫脂椰蓉粕的綜合開發(fā)利用提供廣闊的市場(chǎng)前景。

2.2 脫脂椰蓉SDF提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 混合酶添加量對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響

圖1 混合酶添加量對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of SDF

由圖1可知，混合酶添加量對(duì)SDF得率影響很大。椰蓉SDF得率隨加酶量的增加而逐漸升高，當(dāng)混合酶添加量為0.5%時(shí)，得率達(dá)到8.53%；繼續(xù)增加混合酶添加量，膳食纖維得率開始降低，這可能是因?yàn)橐刂蠭DF水解為SDF，生成了小分子的多糖、低聚糖或單糖，乙醇無法醇沉下來，從而使得SDF得率下降[20-21]。因此混合酶添加量以0.5%左右為宜。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響

圖2 酶解時(shí)間對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of SDF

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，SDF得率逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間為50 min時(shí)，SDF得率最高，為7.17%。繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，得率呈下降趨勢(shì)；這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)混合酶作用于SDF，使得半纖維素等發(fā)生降解，生成小分子的單糖，從而使得率下降[22]。因此酶解時(shí)間選擇50 min左右為宜。

2.2.3 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響

圖3 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響Fig.3 Effect of alkali concentration on the yield of SDF

由圖3可知，當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～5%時(shí)，椰蓉SDF得率不斷增加，當(dāng)添加量為5%時(shí)，得率達(dá)到最大為7.45%；當(dāng)繼續(xù)增加堿液添加量，得率逐漸減低，可能是因?yàn)閴A解過程中大部分椰蓉蛋白質(zhì)溶解于堿液中，可將蛋白質(zhì)和部分淀粉去除，但當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大，椰蓉中的纖維素與堿液發(fā)生反應(yīng)引起纖維素的降解，導(dǎo)致得率降低[23]。因此堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)以5%為宜。

2.2.4 堿解時(shí)間對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響

圖4 堿解時(shí)間對(duì)脫脂椰蓉SDF得率的影響Fig.4 Effect of alkaline hydrolysis time on the yield of SDF

由圖4可知，當(dāng)堿解時(shí)間為10～40 min內(nèi)，椰蓉SDF得率逐漸升高，并在處理時(shí)間為40 min時(shí)，椰蓉SDF得率達(dá)到7.70%。繼續(xù)延長(zhǎng)堿解時(shí)間，SDF得率開始下降；這是因?yàn)楫?dāng)堿解時(shí)間過短時(shí)蛋白質(zhì)水解不完全，造成得率過低，但堿解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成水解時(shí)間過長(zhǎng)，從而使得率下降[24]。因此堿解時(shí)間以40 min左右為宜。

2.3 SDF提取工藝回歸模型的建立及方差分析

應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以X1（混合酶添加量）、X2（酶解時(shí)間）、X3（堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和X4（堿解時(shí)間）為自變量，以SDF得率為響應(yīng)值Y，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析方法對(duì)亞臨界水提取SDF工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表3所示。

對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=11.32+0.87X1+0.22X2+0.31X3+0.098X4－0.47X1X2－0.083X1X3+0.11X1X4－0.22X2X3+0.92X2X4－0.088X3X4－3.03－1.14－1.94－1.32。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table3 Experimental design and results for respond surface analysis

表4 回歸方程方差分析及結(jié)果Table4 Analysis of variance for regression model

由表3可知，所選模型高度顯著（F=79.77，P＜0.000 1），失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.908 8＞0.05），表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合程度較好。對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，表明混合酶添加量X1及二次項(xiàng)、酶解時(shí)間、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、堿解時(shí)間對(duì)SDF得率有高度顯著影響；堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)X3、X1X2對(duì)SDF得率影響極顯著；酶解時(shí)間X2對(duì)SDF得率影響顯著。結(jié)果表明，模型回歸系數(shù)R2為0.987 6，校正決定系數(shù)為0.975 2，表明97.52%的響應(yīng)值變化可用此模型來解釋。因此用此模型對(duì)脫脂椰蓉SDF得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)是可靠的。

2.4 響應(yīng)面分析

圖5 混合酶添加量、酶解時(shí)間、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿解時(shí)間交互作用對(duì)SDF得率的影響Fig.5 Respond surface plots showing the interactive effect of variables on the yield of SDF

由圖5可知，響應(yīng)值隨著各因素水平的增加而增加，達(dá)到最高點(diǎn)后，響應(yīng)值開始逐漸減小?；旌厦柑砑恿亢兔附鈺r(shí)間（X1X2）、酶解時(shí)間和堿解時(shí)間（X2X4）之間交互作用顯著。

2.5 提取工藝條件的優(yōu)化和可靠性驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步確定各因素的最佳取點(diǎn)，利用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，通過分析可得到最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的最佳因素條件：混合酶添加量0.5%、酶解時(shí)間50 min、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、堿解時(shí)間40 min，此工藝下椰蓉SDF理論得率為11.99%。此優(yōu)化提取條進(jìn)進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)際測(cè)得SDF得率平均值為11.78%。與理論值較為接近，表明此模型優(yōu)化脫脂椰蓉SDF提取工藝可靠。

2.6 脫脂椰蓉膳食纖維單糖組成分析

由圖6可知，脫脂椰蓉SDF單糖的保留時(shí)間為甘露糖（16.122 min）、核糖（18.955 min）、鼠李糖（19.585 min）、葡萄糖醛酸（23.469 min）、半乳糖醛酸（25.633 min）、葡萄糖（26.974 min）、氨基半乳糖（27.874 min）、半乳糖（30.262 min）、阿拉伯糖（31.637 min）；由脫脂椰蓉粉SDF高效液相色譜圖可以看出，椰蓉SDF在11.5 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)雜鋒，這是因?yàn)樵跇悠非疤幚磉^程中加入了衍生試劑PMP的原因；脫脂椰蓉SDF由9 種單糖組成，主要單糖成分為甘露糖、氨基半乳糖、半乳糖和阿拉伯糖質(zhì)量濃度較高，分別為537.21、40.38、39.48、15.83 mg/L。

圖6 椰蓉SDF高效液相色譜圖Fig.6 Monosaccharide analysis of SDF from coconut flour

2.7 紅外光譜分析

圖7 脫脂椰蓉及椰蓉SDF紅外光譜對(duì)比圖Fig.7 Infrared spectra of defatted coconut flour and its SDF

由圖7可知，在1 114.15、1 183.62、1 404.63、1 548.75、1 652.09 cm－1處的吸收峰消失，在1 107.06、1 157.21、1 315.35、1 461.92、1 637.43、1 743.65、2 924.09、2 954.95 cm－1出現(xiàn)了新的特征吸收峰。據(jù)此可知，酶-化學(xué)法脫脂椰蓉粉發(fā)生了一定程度的反應(yīng)。

椰蓉S D F具有典型的多糖特征吸收峰，在3 422.76 cm－1存在較大吸收峰，是O—H伸縮振動(dòng)吸收，說明椰蓉SDF處于締合狀態(tài)的氫鍵較多；2 929.29 cm－1處是由飽和C—H伸縮振動(dòng)吸收；1 652.09 cm－1處是糖分子中羰基C=O的伸縮振動(dòng)吸收，1 548 cm－1處是木質(zhì)素苯環(huán)的吸收峰，表示樣品中存在芳香族類有機(jī)物；1 404 cm－1處是由C—H變角振動(dòng)吸收；1 200～1 400 cm－1處是糖分子中C—H鍵的變角振動(dòng)吸收，1 114.15 cm－1處有一強(qiáng)吸收峰，是吡喃糖環(huán)中的O—H變角振動(dòng)吸收峰；873.71 cm－1吡喃糖C—H變形振動(dòng)的特征吸收峰；811.62 cm－1處是由呋喃糖分子中C—H鍵的變角振動(dòng)吸收；619 cm－1有一強(qiáng)吸收峰，可能是存在游離的醇或酚。

2.8 脫脂椰蓉SDF理化性質(zhì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫脂椰蓉SDF持水力（3.8 g/g）高于蔗渣膳食纖維（3.6 g/g）[25]、花生殼膳食纖維（2.64 g/g）[26]、葡萄皮渣膳食纖維（2.98 g/g）[27]；所得膨脹性（3.1 mL/g）高于葡萄皮渣膳食纖維（1.75 mL/g）[27]，與花生殼膳食纖維（3.1 mL/g）相當(dāng)[26]；所得持油性（5.2 g/g）高于蠶豆膳食纖維（4.48 g/g）[29]、花生殼膳食纖維（1.12 g/g）[26]以及葡萄皮渣膳食纖維（1.05 g/g）[28]。由此可見，采用酶-化學(xué)提取的椰蓉膳食纖維理化性質(zhì)更突出，這主要是因?yàn)樵谔崛∵^程中去除椰蓉非膳食纖維成分后，膳食纖維暴露出來的親水集團(tuán)，使得具有更強(qiáng)的吸附性[30]。

2.9 脫脂椰蓉SDF純度測(cè)定結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，椰蓉SDF純度為82.12%。鄭亞軍等[2]研究稀堿法提取椰子SDF工藝操作簡(jiǎn)單、成本低，純度達(dá)到65.18%。本實(shí)驗(yàn)利用酶-化學(xué)法先用糖化酶分解椰蓉中的多糖，淀粉酶去除淀粉，反應(yīng)溫和，使得提取出的SDF純度較高；再用堿除去蛋白質(zhì)，縮短了堿解時(shí)間，從而使蛋白質(zhì)堿解完全，具有工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)溫和、純度高、效率高等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié) 論

采用酶-化學(xué)法提取脫脂椰蓉中的SDF，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化分析，獲得最佳工藝參數(shù)為混合酶添加量0.5%、酶解時(shí)間50 min、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、堿解時(shí)間40 min，在此條件下SDF得率為11.78%；持水力、膨脹性和持油性分別為3.8 g/g、3.1 mL/g和5.2 g/g。紅外光譜分析脫脂椰蓉SDF處于締合狀態(tài)的氫鍵較多；高效液相色譜分析單糖組成結(jié)果表明椰蓉SDF中主要單糖成分為甘露糖、氨基半乳糖、半乳糖和阿拉伯糖質(zhì)量濃度較高，分別為537.21、40.38、39.48、15.83 mg/L。