超聲預(yù)處理對大豆分離蛋白糖基化復(fù)合物酸誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響

趙城彬，許秀穎，劉景圣，張浩，吳玉柱，曹勇，吳非*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

凝膠性作為使蛋白質(zhì)形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，可將水、風味物質(zhì)及脂質(zhì)等成分包裹在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，利用該性質(zhì)能夠有效改善食品的感官及質(zhì)構(gòu)[1]。近年來，蛋白質(zhì)糖基化改性受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，由于該反應(yīng)不需要催化劑，并能在可控的條件下獲得所需的反應(yīng)產(chǎn)物，可以作為新功能性材料應(yīng)用于食品工業(yè)、生物材料及醫(yī)藥科學等領(lǐng)域[2]。很多研究報道了食品體系中蛋白質(zhì)與多糖通過糖基化反應(yīng)進行共價結(jié)合，使蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、凝膠性等功能性質(zhì)得到改善[3]。然而，采用傳統(tǒng)加熱發(fā)生的糖基化反應(yīng)效率低、反應(yīng)時間長，且副產(chǎn)物多、能耗高，不能廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前，超聲技術(shù)作為一種綠色、環(huán)保、無毒害的處理手段被廣泛應(yīng)用于食品加工中。超聲波對蛋白質(zhì)的影響主要包括兩類：一類是將超聲波直接作用于蛋白分子，通過對蛋白分子結(jié)構(gòu)的修飾改善蛋白質(zhì)的功能特性；另一類是在蛋白質(zhì)發(fā)生化學反應(yīng)之前或者整個過程中進行超聲處理，以提高化學反應(yīng)速率或改善對蛋白質(zhì)的修飾作用[4]。Zisu等[5]采用20 kHz、4 000 W超聲處理，能夠降低乳清蛋白和酪蛋白的黏性，增加其凝膠性，同時改善其熱結(jié)合能力及熱穩(wěn)定性。Stanic-Vucinic等[6]利用強度為135 W/cm2、頻率為20 kHz的超聲波在10～15 ℃的低溫和中性pH值下處理β-乳球蛋白和糖的混合溶液60 min，發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白能與多種糖類發(fā)生糖基化反應(yīng)，其中核糖的糖基化程度最高。然而，關(guān)于超聲預(yù)處理下大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）糖基化復(fù)合物凝膠性質(zhì)的研究鮮有報道。本研究對濕熱法制備的SPI/糖復(fù)合物進行超聲預(yù)處理，對其表面疏水性、粒徑、凝膠流變性、凝膠強度、持水性進行分析，探討超聲預(yù)處理對SPI/糖復(fù)合物酸誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的影響，為進一步了解超聲作用下SPI/糖復(fù)合物的凝膠機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)純度為91.8%，由哈高科食品有限責任公司提供。

葡萄糖（glucose，G）、麥芽糖（maltose，M）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；葡萄糖酸內(nèi)酯（glucono-δ-lactone，GDL）北京沃海環(huán)球科技有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2D超聲探頭發(fā)生器 寧波Scientz生物科技股份有限公司；LGJ-1冷凍干燥機 上海醫(yī)用離心機廠；DU800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；TNZ1-5700傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Thermo Fisher公司；PE Pyris 6差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；F2000熒光光譜儀 日本日立公司；Mastersizer 2000激光粒度儀、Bohlin旋轉(zhuǎn)流變儀 英國馬爾文儀器有限公司；TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI/糖復(fù)合物的制備

將SPI分散到磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.0）中，配制質(zhì)量分數(shù)為8%的SPI溶液。以蛋白、糖質(zhì)量比為1∶1分別向SPI溶液中添加葡萄糖和麥芽糖并混合均勻，配制SPI/糖混合液。將混合液在室溫下磁力攪拌2 h，然后4 ℃貯藏過夜以確保SPI完全溶解并充分與糖混勻?？刂瞥暪β蕿?00 W，室溫下分別對混合液進行5、10、20、30 min超聲預(yù)處理。超聲處理模式為開啟3 s、關(guān)閉1 s。超聲預(yù)處理后將混合液置于95 ℃水浴中熱處理15 min，迅速冷卻至室溫得到超聲SPI/糖復(fù)合物溶液，然后冷凍干燥即得超聲SPI/G復(fù)合物和超聲SPI/M復(fù)合物，分別記作U-SPI/G和U-SPI/M。相同的混合液未經(jīng)超聲預(yù)處理直接進行95 ℃水浴熱處理，隨后與超聲SPI/糖復(fù)合物的處理方式相同，得到非超聲SPI/G復(fù)合物和非超聲SPI/M復(fù)合物，分別記作NU-SPI/G和NU-SPI/M。

以不添加糖的SPI樣品為對照組；將SPI在相同的條件下經(jīng)超聲預(yù)處理后，95 ℃水浴加熱15 min，所得樣品為超聲SPI，記作U-SPI；SPI在相同的條件下，未經(jīng)超聲預(yù)處理直接進行95 ℃水浴加熱15 min的樣品為非超聲SPI，記作NU-SPI；未經(jīng)任何處理的SPI為天然SPI。

1.3.2 接枝度測定

采用OPA試劑法測定接枝度。將80 mg OPA溶解在2 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液中，并與50 mL10 mmol/L四硼酸鈉緩沖液（pH 9.7）、5 mL質(zhì)量分數(shù)20% SDS溶液以及200 μL β-巰基乙醇混合，充分混勻后用蒸餾水稀釋至100 mL配成OPA試劑。將200 μL復(fù)合體系樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL OPA試劑在室溫下反應(yīng)5 min，然后采用紫外-可見分光光度計測定340 nm波長處的吸光度，以天然SPI作為對照樣，接枝度（degree of grafting，DG）的計算公式如式（1）所示。

式中：Ac為對照樣的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.3 FTIR測定

參照Zhao Chengbin等[7]的方法測定FTIR光譜，將蛋白樣品與溴化鉀研磨成均勻粉末，壓片后置于FTIR儀中進行測定。測定溫度為25 ℃，波數(shù)掃描范圍為4 000～500 cm－1，分辨率為4 cm－1，波數(shù)精度為0.01 cm－1，掃描次數(shù)為64 次。

1.3.4 熱性質(zhì)測定

采用PE Pyris 6差示掃描量熱儀對樣品的熱性質(zhì)進行分析。取10 μL樣品溶液放入鋁盒中密封，以5 ℃/min的升溫速率由20 ℃加熱到120 ℃，采用空鋁盒作為對照。記錄此過程的吸熱峰溫度（Tp）和熱焓值（ΔH）。

1.3.5 表面疏水性測定

蛋白質(zhì)表面疏水性采用ANS作為疏水熒光探針進行測定。將蛋白樣品溶于pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為0.05～1.00 mg/mL的蛋白溶液，采用相同的緩沖液配制8 mmol/L ANS溶液。將20 μL ANS溶液添加到2 mL蛋白溶液中，充分振蕩混勻。在390 nm激發(fā)波長和470 nm發(fā)射波長處，采用熒光光譜儀測定熒光強度。表面疏水性以熒光強度相對于蛋白質(zhì)量濃度的初始斜率（H0）表征。

1.3.6 粒徑測定

參考齊寶坤等[8]的測定方法，采用Mastersizer 2000激光粒度儀測定粒徑分布。將質(zhì)量分數(shù)8%樣品溶液于室溫下磁力攪拌2 h，4 ℃貯藏過夜以確保樣品完全溶解。測定轉(zhuǎn)速為1 900 r/min，折射指數(shù)和吸收參數(shù)分別為1.46和0.1。平均粒徑采用體積-平均直徑（D43）表示。

1.3.7 酸誘導(dǎo)凝膠的制備

向得到的SPI/糖復(fù)合物溶液中加入質(zhì)量分數(shù)0.8% GDL，保證蛋白質(zhì)與GDL的質(zhì)量比為10∶1。充分混勻后于25 ℃下酸化5 h，酸化結(jié)束后4 ℃冷藏過夜，即得酸誘導(dǎo)凝膠。對照組為不添加糖的SPI凝膠。

1.3.8 凝膠流變性測定

根據(jù)Zhao Chengbin等[9]的方法測定凝膠樣品的流變性。將樣品溶液加入GDL后置于流變儀平板之間，平板距離1 mm，平板間充滿溶液后擦去多余的溶液，滴2～3 滴植物油于溶液裸露部位以防止水分蒸發(fā)，然后加上保溫套準備測定。設(shè)定應(yīng)變?yōu)?.5%，頻率為1 Hz，25 ℃下酸化5 h，進行時間掃描，記錄整個酸化過程中樣品的儲能模量（G’）隨時間的變化。初始應(yīng)變掃描實驗顯示流變性在線性黏彈區(qū)域內(nèi)。

1.3.9 凝膠強度測定

采用TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀對凝膠強度進行測定。將凝膠樣品放于測量臺上，采用P/0.5探頭進行測定，選擇TPA模式，設(shè)置壓縮前、壓縮中、壓縮后的速率分別為3.0、2.0、3.0 mm/s，凝膠壓縮比例為35%，兩次下壓間隔5 s，觸發(fā)力為5 g。測定后得質(zhì)構(gòu)參數(shù)，凝膠強度以最大破裂力（g）表示。

1.3.10 凝膠持水性測定

應(yīng)用離心法測定凝膠持水性，具體步驟參照Choi等[10]的方法。將空離心管稱質(zhì)量后放入適當質(zhì)量的凝膠樣品，設(shè)置離心機轉(zhuǎn)速為4 500 r/min，離心時間為15 min，離心結(jié)束后將離心管取出，室溫下靜置10 min，將上清液吸出后稱質(zhì)量，凝膠持水性計算公式如式（2）所示。

式中：m0為空離心管的質(zhì)量/g；m1為離心前裝有凝膠的離心管質(zhì)量/g；m2為吸出水分后離心管質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)3 次，采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對SPI/糖復(fù)合物接枝度的影響

圖1 SPI與葡萄糖和麥芽糖糖基化復(fù)合物DG隨超聲時間的變化Fig.1 Effect of ultrasonication time on degree of grafting for glycoconjugates of SPI with glucose and maltose

由圖1可以看出，SPI/G復(fù)合物的DG比SPI/M復(fù)合物高，這表明SPI與葡萄糖的反應(yīng)活性比麥芽糖強。未經(jīng)超聲預(yù)處理的SPI/G復(fù)合物和SPI/M復(fù)合物的DG較低，而超聲預(yù)處理能夠使復(fù)合物的DG增加。超聲預(yù)處理20 min時DG達到最大，而超過20 min后DG稍有降低。適當?shù)某曌饔脮淖兊鞍椎目臻g構(gòu)象及結(jié)構(gòu)，使蛋白分子展開，埋藏在蛋白分子內(nèi)部的氨基暴露出來[11]，促進其與糖的碰撞，利于糖基化反應(yīng)的進行，導(dǎo)致DG增加；而過長的超聲時間會使蛋白質(zhì)展開的肽鏈重新聚集，使游離氨基又被重新包埋在蛋白分子內(nèi)部，不利于糖基化反應(yīng)的進行，導(dǎo)致DG稍微降低。因此，選擇超聲時間為20 min進行后續(xù)實驗。

2.2 SPI/糖復(fù)合物FTIR結(jié)果分析

FTIR對于蛋白質(zhì)-碳水化合物體系的研究是一種非常有效的技術(shù)，該技術(shù)通過分子內(nèi)原子間的振動產(chǎn)生輻射吸收，從而提供化合物的化學組成和構(gòu)象結(jié)構(gòu)信息等[12]。圖2為非超聲和超聲預(yù)處理下SPI/糖復(fù)合物的FTIR圖譜，與天然SPI相比，無論是否進行超聲預(yù)處理，SPI/糖復(fù)合物均在3 200～3 700 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)一個寬峰，在1 000～1 260 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯吸收峰，這是糖分子以共價鍵與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的典型特征[13]。前者是由糖分子和水分子中的羥基發(fā)生伸縮振動引起的，后者是由糖分子中碳氧鍵的伸縮振動產(chǎn)生的[14]，這表明糖分子與SPI發(fā)生了糖基化反應(yīng)，使糖基化共價復(fù)合物中羥基和碳氧鍵數(shù)量增加，導(dǎo)致相應(yīng)的吸收峰增強。SPI/M復(fù)合物在3 200～3 700 cm－1和1 000～1 260 cm－1波數(shù)范圍的吸收峰比SPI/G復(fù)合物更寬、更強，這是由于麥芽糖比葡萄糖具有更多能夠在此處產(chǎn)生吸收峰的基團。此外，SPI/糖復(fù)合物在1 658（酰胺I帶）、1 542（酰胺II帶）和1 405 cm－1（酰胺III帶）處的吸收峰均發(fā)生不同程度的變化，這也表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從側(cè)面說明了糖基化反應(yīng)的發(fā)生。

圖2 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI/糖復(fù)合物的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

2.3 SPI/糖復(fù)合物熱性質(zhì)分析

表1 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物的熱力學參數(shù)Table1 Thermodynamic parameters of SPI and SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

在一定升溫和降溫的過程中，蛋白質(zhì)的熱量變化可以通過差示掃描量熱法進行測定，測定指標包括Tp和ΔH。如表1所示，天然SPI中7S球蛋白和11S球蛋白的Tp分別為73.36 ℃和91.58 ℃。無論是否進行超聲預(yù)處理，在95 ℃下對SPI進行熱處理15 min，7S球蛋白和11S球蛋白的吸熱峰均消失，表明在此條件下7S球蛋白和11S球蛋白均發(fā)生完全變性。然而，SPI/糖復(fù)合物的7S球蛋白組分發(fā)生完全變性，而11S球蛋白組分只發(fā)生了部分變性，形成了具有更高Tp的熱聚集體。這說明葡萄糖和麥芽糖與SPI發(fā)生糖基化作用能夠抑制蛋白質(zhì)熱變性，并形成具有更高熱穩(wěn)定性的聚集體。Medrano等[15]在對β-乳球蛋白與葡萄糖或乳糖糖基化復(fù)合物的研究中也得到了相似的結(jié)果。此外，SPI/G復(fù)合物與SPI/M復(fù)合物的11S球蛋白組分Tp和ΔH值沒有顯著差異（P＞0.05），且超聲預(yù)處理對復(fù)合物11S球蛋白組分的熱力學參數(shù)影響也不顯著（P＞0.05）。

2.4 SPI/糖復(fù)合物表面疏水性分析

圖3 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物的表面疏水性（H0）Fig.3 Surface hydrophobicity （H0） of SPI and SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

表面疏水性是反映極性水環(huán)境中蛋白質(zhì)分子表面疏水基團數(shù)目的指標，也是影響蛋白質(zhì)功能性的一個重要因素[16]。如圖3所示，與天然SPI相比，未經(jīng)超聲處理直接對SPI加熱會使H0顯著增加（P＜0.05），這是由于加熱能夠引起蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，使疏水殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面[17]。與熱處理SPI相比，SPI/糖復(fù)合物的H0均降低，這表明糖基化會阻礙熱處理過程中蛋白質(zhì)的變性，從而減少疏水殘基的暴露，這與Kaye等[18]的研究結(jié)果一致。SPI/G復(fù)合物的H0比SPI/M復(fù)合物顯著降低（P＜0.05），同時SPI/G復(fù)合物的DG比SPI/M復(fù)合物高（圖1），這表明較高的DG會導(dǎo)致疏水性的降低。Achouri等[19]的研究發(fā)現(xiàn)11S大豆球蛋白疏水性的降低與葡萄糖DG的增加有關(guān)。此外還有研究顯示，隨著更多的多糖與蛋白質(zhì)接枝，蛋白質(zhì)分子表面疏水環(huán)境減弱得更快[20]。

超聲體系的H0比非超聲體系顯著增加（P＜0.05），這表明超聲預(yù)處理能夠明顯增加熱處理SPI和SPI/糖復(fù)合物的H0，這與Chen Lin等[21]的研究結(jié)果相似，他認為超聲處理能夠?qū)е耂PI表面疏水性的增加。超聲使H0增加的原因可能是其引起的空化作用和微流束作用導(dǎo)致原本埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露在分子表面[22]。此外，非超聲SPI/M復(fù)合物的H0與超聲SPI/G復(fù)合物之間差異不顯著（P＞0.05）。對于熱處理SPI，糖基化能夠通過阻礙SPI的熱變性來減少疏水殘基暴露，而糖基化前的超聲處理能夠弱化這種阻礙作用（如具有較高DG的SPI/G復(fù)合物）或使更多的疏水基團暴露到SPI分子表面（如具有較低DG的SPI/M復(fù)合物）。這一發(fā)現(xiàn)表明，超聲預(yù)處理能夠降低糖基化對熱處理SPI分子展開的抑制作用。

2.5 SPI/糖復(fù)合物粒徑分析

圖1 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物的粒徑分布（A）和平均粒徑（B）Fig.1 Particle size distribution （A） and average particle size （B） of SPI and SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

由圖4A可以看出，SPI/糖復(fù)合物與天然SPI一樣呈單峰粒徑分布，但是會出現(xiàn)更多較小的粒徑。超聲預(yù)處理使SPI粒徑由較寬的分布變?yōu)檩^窄的分布，但不能使SPI/糖復(fù)合物的粒徑分布發(fā)生明顯改變，這與Arzeni等[23]的研究結(jié)果一致。由圖4B可以看出，熱處理能夠使SPI的D43顯著降低（P＜0.05），這可能是熱處理使較大的蛋白質(zhì)聚合物溶解導(dǎo)致的[24]。無論在非超聲還是超聲預(yù)處理條件下，SPI/糖復(fù)合物的D43都顯著低于熱處理SPI（P＜0.05）。根據(jù)Gu Xin等[25]的研究結(jié)果，這可能是由于糖基化阻礙了熱處理過程中蛋白質(zhì)的變性，從而減少了蛋白質(zhì)分子的聚集，導(dǎo)致SPI粒徑減小。此外，SPI/M復(fù)合物比SPI/G復(fù)合物具有更大的D43，這表明糖分子大小會影響SPI/糖復(fù)合物的粒徑。超聲處理導(dǎo)致所有體系D43更明顯降低，超聲處理后粒徑的減小可能是由超聲引起的空化作用和微流束作用破壞了SPI分子之間的非共價鍵造成的[26]。這與Jambrak等[27]報道的超聲處理能夠改變蛋白質(zhì)粒徑大小的研究結(jié)果類似。

2.6 SPI/糖復(fù)合物凝膠流變性分析

如圖5所示，無論是否采用超聲處理，SPI/糖復(fù)合物在酸化過程中G’的增長趨勢與熱處理SPI相似，這與Kontogiorgos等[28]的研究結(jié)果相同。所有體系的G’隨著酸化時間的延長而逐漸增加，最終達到一個平衡值，這與酸化過程中pH值下降到SPI等電點附近引起蛋白質(zhì)聚集形成酸凝膠有關(guān)[29]。此外，超聲預(yù)處理不會使SPI的G’增長速率發(fā)生改變，但會顯著提高SPI/糖復(fù)合物G’的增長速率。

圖5 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物酸化過程中G’的變化Fig.5 Changes in G’ of SPI and SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment during acidi fi cation

圖6 非超聲和超聲預(yù)處理下酸化5 h后SPI和SPI/糖復(fù)合物酸化后的G’Fig.6 G’ of SPI and SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment after fi ve hours acidi fi cation

由圖6可知，無論是否采用超聲預(yù)處理，酸化5 h后SPI/糖復(fù)合物的G’都顯著低于SPI（P＜0.05），這表明糖基化作用會弱化凝膠結(jié)構(gòu)。在糖基化過程中，糖通過提高蛋白質(zhì)熱變性溫度而阻礙了蛋白質(zhì)的變性，這會減少GDL酸化過程中蛋白質(zhì)的聚集，影響化學鍵的形成，導(dǎo)致凝膠的弱化[25]。此外，SPI/G復(fù)合物的G’顯著低于SPI/M復(fù)合物（P＜0.05），這可能與DG有關(guān)（圖1）。具有高DG的葡萄糖對蛋白質(zhì)變性的阻礙作用比麥芽糖更顯著，從而導(dǎo)致其形成更弱的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這也與本研究中表面疏水性的分析結(jié)果一致（圖3），葡萄糖具有比麥芽糖更顯著的阻礙蛋白質(zhì)變性的作用。

然而，與未經(jīng)超聲預(yù)處理的SPI和SPI/糖復(fù)合物相比，超聲預(yù)處理能夠使G’顯著增加（P＜0.05），這表明超聲處理能夠強化凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。盡管糖基化作用會阻礙蛋白質(zhì)變性，但是超聲處理還是會使埋藏在SPI分子內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露（圖3），這對疏水相互作用形成凝膠非常有利。Zhao Chengbin等[30]的研究也得到了相似的結(jié)果。此外，超聲處理減小了SPI和SPI/糖復(fù)合物的粒徑（圖4），有利于SPI酸誘導(dǎo)凝膠的形成。這與Hu Hao等[31]的研究結(jié)果一致，他指出由超聲引起SPI粒徑的減小會強化凝膠結(jié)構(gòu)。此外，與SPI凝膠相比，盡管糖基化作用弱化了凝膠網(wǎng)絡(luò)，但是超聲處理會降低（如超聲SPI/G復(fù)合物）或消除（如超聲SPI/M復(fù)合物）這種對凝膠的弱化作用，甚至會改善凝膠性質(zhì)。

2.7 SPI/糖復(fù)合物凝膠強度分析

圖7 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物的凝膠強度Fig.7 Gel strength of SPI and SPI/sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

如圖7所示，無論是否進行超聲預(yù)處理，SPI/糖復(fù)合物的凝膠強度都顯著低于SPI凝膠（P＜0.05），這表明糖基化作用會降低SPI的凝膠強度。這可能是由于糖基化作用抑制了蛋白質(zhì)的熱變性，使埋藏在蛋白分子內(nèi)部的活性基團不能夠充分地暴露，從而影響酸化過程中蛋白分子的聚集與交聯(lián)[32]。與SPI/M復(fù)合物相比，SPI/G復(fù)合物具有更低的凝膠強度，這可能是SPI/G復(fù)合物具有更高的DG造成的（圖1）。具有高DG的SPI/G復(fù)合物表面疏水性更低（圖3），這不利于蛋白質(zhì)通過疏水相互作用形成更牢固的凝膠網(wǎng)絡(luò)。

無論是SPI還是SPI/糖復(fù)合物，超聲預(yù)處理均能夠使其凝膠強度顯著提高（P＜0.05）。超聲作用會促使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水區(qū)域暴露，蛋白質(zhì)通過疏水相互作用形成凝膠網(wǎng)絡(luò)可能是凝膠強度增加的重要原因。Sun Yanjun等[33]對復(fù)原乳濃縮蛋白凝膠性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，超聲作用會顯著增強乳蛋白的凝膠強度，這與本研究結(jié)果一致。此外，SPI與麥芽糖發(fā)生糖基化反應(yīng)雖然會降低蛋白質(zhì)的凝膠強度（如非超聲SPI/M復(fù)合物凝膠強度低于SPI凝膠），但是超聲作用會使SPI/M復(fù)合物的凝膠強度再次高于SPI凝膠，從而起到了改善SPI凝膠性質(zhì)的作用。

2.8 SPI/糖復(fù)合物凝膠持水性分析

圖8 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物凝膠的持水性Fig.8 Water-holding capacity of SPI and SPI/sugar conjugate gels with and without ultrasonic pretreatment

凝膠在受到外力的作用下對水的保留能力為凝膠的持水性，它反映了凝膠在破裂過程中水分的釋放特性，凝膠的持水性與其微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)有關(guān)[28]。由圖8可以看出，無論是否進行超聲預(yù)處理，SPI/糖復(fù)合物凝膠的持水性都顯著低于SPI凝膠（P＜0.05），這可能是由于糖基化作用使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加松散，空間結(jié)構(gòu)空隙增大，不利于水分的保持。SPI/M復(fù)合物凝膠的持水性比SPI/G復(fù)合物凝膠更高，這可能與SPI/M復(fù)合物較低的DG有關(guān)（圖1）。此外，麥芽糖比葡萄糖具有更多的羥基，使SPI/M復(fù)合物具有更高的親水性，這也可能有利于糖基化蛋白與水分子的相互作用，從而改善凝膠持水性。

無論是SPI還是SPI/糖復(fù)合物，超聲預(yù)處理均能夠顯著提高凝膠的持水性（P＜0.05）。超聲作用會促進蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的強化，形成均一、結(jié)構(gòu)緊密的凝膠，這有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)對水的包裹，導(dǎo)致持水性的增加。Zhao等[34]證實了超聲處理對凝膠網(wǎng)絡(luò)的強化和加固作用是導(dǎo)致凝膠持水性增加的原因。Riener等[35]對傳統(tǒng)熱處理酸奶和超聲熱處理酸奶品質(zhì)進行比較，發(fā)現(xiàn)超聲熱處理酸奶品質(zhì)較好，超聲處理能夠使酸奶凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強，提高酸奶的持水性，這與本研究結(jié)果相似。持水性作為蛋白質(zhì)凝膠的一種重要性質(zhì)，在超聲作用下能夠得到顯著提高（P＜0.05），這再次證明適當?shù)某曁幚砟軌蚋纳频鞍踪|(zhì)的凝膠性質(zhì)。

3 結(jié) 論

將SPI與葡萄糖和麥芽糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，SPI與葡萄糖的反應(yīng)活性比麥芽糖強，超聲預(yù)處理20 min時，SPI/糖復(fù)合物的DG最大。FTIR分析表明，無論是否進行超聲預(yù)處理，葡萄糖和麥芽糖均能與SPI形成共價復(fù)合物。糖基化作用會降低SPI的H0和D43，這是糖基化阻礙了熱處理過程中蛋白質(zhì)的變性導(dǎo)致的。然而，超聲產(chǎn)生的空化作用和微流束作用能夠使SPI/糖復(fù)合物具有更高的H0和更低的D43。凝膠性質(zhì)分析表明，糖基化作用通過抑制SPI的熱變性，從而減小酸化過程中蛋白分子間的疏水相互作用，不利于SPI聚集與交聯(lián)，導(dǎo)致SPI酸誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)弱化，宏觀上表現(xiàn)為凝膠強度的減弱和凝膠持水性的降低。然而，超聲預(yù)處理能夠降低或消除糖基化反應(yīng)對SPI酸誘導(dǎo)凝膠的弱化作用，甚至能夠改善蛋白質(zhì)凝膠強度和持水性。