高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中喹乙醇代謝物

□ 程春霞 王成梅 山東中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司

喹乙醇是一種合成的飼料添加劑，因?yàn)榫哂袕V譜抗菌效果和促生長(zhǎng)作用而廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)品養(yǎng)殖。經(jīng)研究表明，喹乙醇會(huì)在體內(nèi)存積，具有明顯的蓄積毒性和DNA損傷等副作用。1998年歐盟禁止其應(yīng)用于可食性動(dòng)物?！吨袊?guó)獸藥典》2005版也明確規(guī)定禁止在家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用喹乙醇。喹乙醇本身并不穩(wěn)定，在體內(nèi)短時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生代謝，其代謝物有十幾種，大部分不是很穩(wěn)定，不具備檢測(cè)條件，只有3-甲基喹惡啉-2-羧酸（MQCA）比較穩(wěn)定，可以作為檢測(cè)的主要代謝物，是國(guó)家食品法典委員會(huì)認(rèn)定的標(biāo)示殘留物[1]。因此在檢測(cè)的過(guò)程中主要將其作為殘留分析和監(jiān)控的目標(biāo)物。

目前國(guó)際上對(duì)于喹乙醇代謝物的提取和檢測(cè)目前主要是通過(guò)酶解衍生，固相萃取凈化。該方法普遍存在著檢出限高、回收率低、操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí)耗力的缺點(diǎn)，不適用于大批量的檢測(cè)。怎么才能快速的從豬肉中將其喹乙醇代謝物提取出來(lái)，是我們研究的主要方向。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不過(guò)SPE柱，直接用2%偏磷酸甲醇（4∶1）溶液、乙酸乙酯提取，目標(biāo)物分離效果好，基質(zhì)干擾很少，檢出限0.1 μg/kg、陽(yáng)性加標(biāo)完全能達(dá)到檢測(cè)要求，大大節(jié)省了時(shí)間，降低了檢測(cè)成本，提高了回收率，提高了工作效率[2]。因此本實(shí)驗(yàn)采用該方法作為我們的提取方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司，型號(hào)Agilent1260/6460)、電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，型號(hào)Secura513-1CN）、高速冷凍離心機(jī)(SIGMA公司，型號(hào)3K15)、純水機(jī)(北京普析，型號(hào)GWB-2E)、多功能振蕩器(德國(guó)海道夫公司，型號(hào)Multi Reax)、超聲波(天津奧特賽恩斯，型號(hào)AS30600BDT)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA公司，型號(hào)RV10)[3]。

3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)(德國(guó) Dr.Ehrenstorfer GmbH 公 司 )；3-甲基喹惡啉-2-羧酸-d4(MQCA-d4，加拿大TRC公司)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯( 色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜純，國(guó)藥)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取10 mg MQCA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確稱取1 mg MQCA-d4標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL，MQCA-d4L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃以下避光保存[4]。

1.2 樣品前處理

取豬肉樣品充分絞碎，置于清潔樣品容器中，-20℃以下避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

稱取2.5 g樣品于50 mL離心管中，加入一定量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度為2.0 ng/mL。加入10 mL 2%偏磷酸甲醇（4∶1）溶液，渦旋10min，超聲20min，離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并提取液。在提取液中加入10 mL乙酸乙酯，渦旋10 min，超聲20 min，離心5min轉(zhuǎn)移上層（乙酸乙酯層）于干凈雞心瓶中，下層重復(fù)提取一次，合并提取液。在45 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1 mL 0.1%甲酸乙腈（9∶1）溶液定容，過(guò)0.22 μm濾膜到進(jìn)樣小瓶中，LCMS/MS上機(jī)檢測(cè)[5]。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Infinity Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)。柱溫：35 ℃。流動(dòng)相：乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速為0.4 mL/min。進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，在ESI正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行掃描，分別對(duì)MQCA和MQCA-d4進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)待測(cè)物的信噪比優(yōu)化最佳噴霧電壓，獲得最佳優(yōu)化條件：氣體溫度350 ℃，氣體流量13 L/min，噴霧器壓力40psi。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

在MRM模式下，喹乙醇代謝物的譜圖見(jiàn)圖。

1.4.3 線性方程與檢出限

配制MQCA的質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度均為2.0 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～10 μg/L范圍內(nèi)線性范圍良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999，見(jiàn)圖2。

以加標(biāo)樣本中待測(cè)化合物色譜峰的信噪比等于3對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限，確定豬肉中的MQCA的檢出限為0.1 μg/L。該方法檢出限比標(biāo)準(zhǔn)上0.5 μg/L高出很多，比很多文獻(xiàn)中的0.27 μg/L也高很多，證明在該方法條件下喹乙醇代謝物響應(yīng)值高，該方法優(yōu)于正常的檢測(cè)方法。

1.4.4 回收率試驗(yàn)及精密度

取豬肉陰性樣品，通過(guò)加入3個(gè)不同濃度的標(biāo)品測(cè)定其不同濃度下的回收率，實(shí)驗(yàn)表明在0.5～5.0 μg/kg范圍內(nèi)，豬肉中回收率在77.6%～92.2%范圍內(nèi)，符合正常檢測(cè)的范圍?；厥章始熬芏纫?jiàn)表3。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

表2 喹乙醇代謝物的質(zhì)譜條件

圖1 喹乙醇代謝物的色譜圖

圖2 喹乙醇代謝物的線性方程

表3 喹乙醇代謝物的回收率及精密度

2 結(jié)果與討論

由于喹乙醇代謝物在體內(nèi)是與蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合狀態(tài)存在的，因此第一步需要將喹乙醇代謝物游離出來(lái)。目前有關(guān)這方面的報(bào)道有酸解、堿解、酶解，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)偏磷酸將其游離，喹乙醇代謝本身具有酸性，其水解液在酸性條件下可以通過(guò)乙酸乙酯提取出來(lái)，具有良好的提取率，同時(shí)酸解時(shí)間相比較酶解衍生16 h，大大縮短了時(shí)間。因此本實(shí)驗(yàn)采用偏磷酸甲醇酸解，然后通過(guò)乙酸乙酯提取。本方法不過(guò)SPE柱，前處理方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作、靈敏度高、回收率高、節(jié)約成本，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，適用于豬肉中喹乙醇代謝殘留標(biāo)示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留的檢測(cè)。