GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》之5.1凱氏定氮法具體操作疑難解析

□ 王金燦 珠海市食品藥品檢驗所

本文對GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中4、5兩部分的22處模糊、疑惑之處，一一詳細做了解析。

“5.1.1試樣處理”

這一步驟其實包含兩個操作：樣品的制作和試樣的消化。樣品是為了試驗而在被檢驗對象中抽取原材料、半成品、成品等，試樣是經(jīng)過物理或化學(xué)處理過的（不影響試驗的）樣品（如烘干、粉碎、去脂肪、混勻等），這點做地質(zhì)樣或煤炭分析的檢驗員就特別清楚。所以，“試樣處理”應(yīng)該是“樣品處理”，后面的固體試樣、半固體試樣、液體試樣都是樣品，而不是試樣，最好稱固態(tài)樣品、半固態(tài)樣品、液態(tài)樣品。

“充分混勻”

要想充分混勻固態(tài)食品就是另一個較大的問題，如何混勻？是否有固定的方法？筆者建議一般的固態(tài)食品按具體情況采用分樣器縮分法、四分法、點取法中的一種。比如，大米、面粉、白糖都好混勻，但像月餅、蛋糕、火腿等就不好混勻，用機器混合就會結(jié)成一坨。筆者建議先烘干再混勻，計算結(jié)果時記得將水分還原即可。半固態(tài)食品、液態(tài)食品樣品本身就已經(jīng)非常均勻，取樣前用搖勻等方法即可。

“試樣移入定氮瓶”

稱量好的試樣如何移入定氮瓶？筆者建議采用兩種辦法：①將稱量紙上的樣品沿著事先折好的凹線倒入定氮瓶中；②對于黏附性較大或易揚塵的試樣，可將稱量紙一并放入定氮瓶中（記得不要計入稱量紙的質(zhì)量）。

“100 mL、250 mL或500 mL定氮瓶”

什么時候用多大的定氮瓶？這要根據(jù)試樣的密度、含蛋白質(zhì)的量來決定。根據(jù)試樣的體積，一般使用100 mL、250 mL的定氮瓶，盡量使用容量更小的定氮瓶，因為越大的定氮瓶在洗滌定氮瓶時使用的蒸餾水越多，給后續(xù)的定容100mL試驗帶來更高要求。

“于瓶口放一小漏斗”

放小漏斗的目的是防止定氮瓶中的酸性溶液爆沸而飛濺出來，應(yīng)于通風(fēng)柜中操作，同時定氮瓶的瓶口要以45°斜支（不得對準通風(fēng)柜外側(cè)，以免傷人）于有小孔的石棉網(wǎng)上。

“小心加熱”

要小火加熱，使用可調(diào)電爐，逐漸加大火力，仔細觀察。目的是使內(nèi)容物全部碳化，泡沫完全停止。

“取下放冷，小心加入20 mL水，放冷后，移入100 mL容量瓶中”

取下放冷至室溫，小心加入20 mL水的要求是：20 mL水用移液管吸取并沿著定氮瓶的瓶壁加入，且一邊緩慢加水一邊用另一只轉(zhuǎn)動定氮瓶瓶身，順便洗滌一次定氮瓶。從定氮瓶中將溶液移入100 mL的容量瓶中，要用上述用來防止爆沸的小漏斗。

“少量水洗定氮瓶”

在洗滌定氮瓶時，也要洗滌小漏斗外壁及頸部的外部。那么如何使用少量蒸餾水洗瓶來洗滌燒杯、錐形瓶、定氮瓶等容器的內(nèi)壁呢？①洗瓶的玻璃嘴要對準容器內(nèi)壁的上部，且距離不能太遠，1 cm左右合適；②右手持洗瓶，將玻璃嘴對準容器內(nèi)壁上部噴灑蒸餾水的同時順時針旋轉(zhuǎn)洗瓶，且左手持容器（此處為定氮瓶）的瓶頸逆時針旋轉(zhuǎn)。這樣一邊洗將溶液移入漏斗中。

“5.1.2 測定”

此處的小標題文不對題，應(yīng)該是“5.1.2蒸餾準備”。

“按圖1裝好定氮蒸餾裝置”

安裝定氮蒸餾裝置需遵循從后往前、由下而上的原則。即安裝的順序是：①蒸餾液接收瓶；②冷凝管（以適當?shù)母叨辱F夾固定?。?；③定氮裝置（以適當?shù)母叨辱F夾固定住，保證加試樣處理液的小玻杯水平，并注意與冷凝管的鏈接）；④2 L的水蒸氣發(fā)生器（事先將打好雙孔的橡皮塞或軟木塞裝好水蒸氣導(dǎo)管及安全管，安全管下端要插入水溶液液面離瓶底1cm處左右，安全管瓶外高度40cm左右為宜）；⑤電爐（實際操作時使用的都是與燒瓶相適應(yīng)的電加熱套，應(yīng)以燒瓶的高度位置來定電加熱套的高度位置，同時注意水蒸氣導(dǎo)管與定氮裝置的鏈接口是否在同一水平線）；⑥在電加熱套下安置升降臺以調(diào)節(jié)整套定氮蒸餾裝置。如圖2所示。

圖1 定氮蒸餾裝置圖1-電爐；2-水蒸氣發(fā)生器（2 L燒瓶）；3-螺旋夾；4-小玻杯及棒狀玻塞；5-反應(yīng)室；6-反應(yīng)室外層；7-橡皮管及螺旋夾；8-冷凝管；9-蒸餾液接收瓶

“保持水呈酸性”

加甲基紅乙醇溶液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸的目的是使水蒸氣發(fā)生器中的蒸餾水呈酸性，加甲基紅乙醇指示劑5滴左右，5 mL左右的濃硫酸（沿瓶壁緩慢加入，此時溶液呈玫瑰紅色），同時加入數(shù)粒玻璃珠。

圖 2實際操作中安裝好的定氮蒸餾裝置圖

“加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰”

加熱煮沸蒸餾水時，圖1中的螺旋夾（7處，也是試驗結(jié)束后少量冷凝水的排出口）是松開的，是蒸汽出口。要使水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水沸騰保持狀態(tài)，要控制好電加熱套的火力。

“5.1.3”

此處應(yīng)該有一個小標題，應(yīng)該是：“5.1.3蒸餾”。

“向接收瓶內(nèi)加入10.0 mL硼酸溶液”

由于加入的硼酸溶液只有10.0 mL，所以用來接收冷凝下來的蒸餾液的錐形瓶（又名三角燒瓶）就不能大，容積為100 mL的錐形瓶正好夠用，要保證硼酸溶液的液面有2 mm左右的高度有可能讓冷凝管的下端插入液面下。

“使冷凝管的下端插入液面下”

定氮蒸餾裝置配套的冷凝管的末端有一個防止倒吸的凸出球狀部分，被錐形瓶的瓶口擋?。?00 mL錐形瓶的瓶口不夠大）而不能插入液面，或有時候的冷凝管的下端不是平口而是斜口，這種情況就需要在冷凝管下端加一節(jié)同樣外徑的玻璃管（長4 cm左右）。若冷凝管的下端是斜口，則必須要將冷凝管的下端的斜口截斷，用乳膠管或橡膠管鏈接起來（冷凝管下端截口與外接玻璃管的截口都必須磨平，且盡可能對接緊密，乳膠管或橡膠管是不接觸溶液的。同理，定氮裝置與水蒸氣發(fā)生器的連接也是如此，乳膠管或橡膠管是不接觸蒸汽的）。

“準確吸取2.0 mL～10.0 mL試樣處理液”

此處指用刻度移液管吸取試樣處理液。何時需要精確稱取或量??？只有出現(xiàn)在計算公式中的參數(shù)是必須精確稱取或量取的，譬如此實驗中的試樣質(zhì)量、吸取消化液（試驗過程中稱試樣處理液）的體積、滴定過程中消耗標準酸的體積。

“立即將玻塞蓋緊，并水封”

將10.0 mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室再立即蓋塞水封，并沒有將小玻杯上殘留的氫氧化鈉沖洗到反應(yīng)室，原因是氫氧化鈉是過量的，是不參與計算的。水封的目的是防止反應(yīng)過程中反應(yīng)室內(nèi)的氣體從此逸出（反應(yīng)室內(nèi)壓力大于反應(yīng)室外），若有氣泡產(chǎn)生說明裝置漏氣，試驗重來。此外，試驗中要水封處還有3處：①定氮裝置與冷凝管上端的連接處（此處是最容易漏氣又絕對不能漏氣處，另外，此處在安裝時易折斷，要小心安裝）；②水蒸氣發(fā)生器的雙孔的橡皮塞或軟木塞與燒瓶之間，雙孔與玻璃管連接處；③圖1中的螺旋夾（7處），要先將乳膠管或橡膠管對折后再夾緊螺旋夾。

“夾緊螺旋夾，開始蒸餾”

此處夾緊的螺旋夾是定氮裝置的下端（7處）出氣口，目的是使蒸汽進入反應(yīng)室，給反應(yīng)提供熱能，以便反應(yīng)生成的氨水及時分解成氨氣，而隨著蒸汽進入冷凝管被冷卻。

“移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端”

要想冷凝管下端離開蒸餾液接收瓶中的液面，最好在蒸餾液接收瓶的底部事先墊兩三張硬紙片（如圖2所示）。這樣要使冷凝管下端離開蒸餾液接收瓶中的液面只需移去硬紙片即可。

“再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部”

再蒸餾1 min的目的是用蒸汽沖洗冷凝管內(nèi)壁殘留的氨水，沖洗冷凝管下端外部也是沖洗冷凝管外壁殘留的溶液。

“盡快以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定至終點”

“盡快”前面應(yīng)該有一個小標題，應(yīng)該是：“5.1.4滴定”。要盡快，是因為蒸餾液是偏堿性溶液（硼酸銨溶液），且空氣中CO2對應(yīng)的碳酸比硼酸酸性強，對滴定終點有較大影響。為盡量減少空氣對試驗的影響，所以滴定所用時間盡可能短些更好。

“A混合指示液，終點顏色為灰藍色或B混合指示液，終點顏色為淺灰紅色”

兩種指示劑的終點顏色分別為灰藍色、淺灰紅色，都不是很明顯容易分辨的顏色，可爭辯性很大。為解決此問題，筆者認為應(yīng)三人同時做三組空白試驗，將溶液顏色突變時的顏色定為溶液終點顏色（事實上常規(guī)的滴定也是如此判定的），而不再糾結(jié)灰藍色、淺灰紅色或錐形瓶中溶液越看越不對，因為：①隨著實驗環(huán)境、配制混合指示劑的人、指示劑的不同，終點顏色都不可能完全一致，②空氣對此試驗的滴定過程。