我國常見海洋神經(jīng)毒素的毒性脫除消減方法研究進展

丁 婕，歐 杰，李曉暉，盧 瑛，*

(1.上海海洋大學食品學院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室，上海201306;2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306)

近幾年，由于國家對海洋重視度的提高，海洋中的活性物質(zhì)研究與開發(fā)便成為海洋資源利用的熱門。而活性物質(zhì)中的海洋神經(jīng)毒素，因具有鎮(zhèn)痛、抗癲癇及其他神經(jīng)性疾病的治療等原因，成為世界各國海洋活性物質(zhì)研究中心的寵兒［1］。在我國，目前最常見的海洋神經(jīng)毒素分別是麻痹性貝類毒素(Paralytic shellfish poisoning toxins，PSP)、河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)、?？舅?Palytoxin，PLTX)和芋螺毒素(Conotoxin，CTX)，本文將對海洋生物毒素的脫除進行綜述說明。

1 海洋神經(jīng)毒素

1.1 麻痹性貝類毒素

麻痹性貝類毒素(PSP)是海洋中的有毒藻類產(chǎn)生的有機物［2－3］，這些藻類在水域中分布廣泛，目前已經(jīng)在巴西、美國和澳大利亞等國家發(fā)現(xiàn)這些藻類的存在。美國食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定麻痹性貝類毒素的食用安全限量為不超過800 mg STXdi HCl－eq./kg，我國規(guī)定上市貝類的麻痹性貝類毒素含量必須低于 800 mg STXdi HCl－ eq./kg［4－7］。當人體內(nèi)的PSP濃度大于1.2×10－9mol/L時，PSP便與位于細胞膜上的鈉通道結合，從而使神經(jīng)與肌肉組織的細胞膜上鈉通道減少。PSP可以導致神經(jīng)中毒的一系列的癥狀:身體麻木、吞咽困難，嚴重者甚至死亡［8－11］。

1.2 河豚毒素

河豚毒素(TTX)最初是從河豚魚中提取出來的，卵巢、肝臟、肌肉、皮膚等組織中均被發(fā)現(xiàn)［12］。隨后在刺魨、鸚哥魚、甲殼類、宏觀藻類中均發(fā)現(xiàn)了TTX［13－15］。TTX 是世界上最致命的生物毒素之一［16］，毒性是氰化鈉的1250倍，0.5 mg就可以致人于死命［17］。誤食河豚魚食者大約在20 min內(nèi)就會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀麻痹癥，呼吸系統(tǒng)衰弱、心臟不規(guī)律跳動和痙攣，繼而導致死亡［18］。

1.3 ?？舅?/h3>

?？舅?PLTX)是一種高毒性的非聚合物分子，最初從沙群?？麑俚募~扣珊瑚中提取出來［19］。后來在蠣甲藻科的鞭毛藻類和束毛藻屬中的藍細菌中也發(fā)現(xiàn)了?？舅氐拇嬖冢?0－21］?，F(xiàn)在，已經(jīng)在不同的海洋生物體中檢測到了多種的PLTX類似物［22］。?？舅匾话阍跓釒ШＱ笊矬w中累積，然后通過食物鏈傳遞到消費者的身體內(nèi)［23－24］，使消費者出現(xiàn)全身不適、肌痛、呼吸窘迫等一系列中毒癥狀，嚴重者甚至會死亡。目前關于海鮮中并沒有官方的食用安全限量，但是歐洲食品安全局(EFSA)建議最大限量為 30 mg PLTXs/Kg［25］。

1.4 芋螺毒素

芋螺毒素(CTX)主要由芋螺毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺分泌。我國的芋螺主要分布在西沙群島、海南島及臺灣海域等熱帶海洋淺水區(qū)［26］。CTX的毒性相對于其他幾種海洋生物毒素較弱。小鼠腹腔注射1 mg即可使其死亡，而對金魚腹腔注射，其致死量大約在15～60 mg·kg－1。根據(jù)其作用于機體的不同靶標，可將芋螺毒素分為三類，分別是作用于電壓門控離子通道，作用于配體門控離子通道和作用于其他受體通道［27］。芋螺毒素在疾病治療中有著廣泛的應用，主要包括慢性疼痛、運動障礙、痙攣、癌癥和中風［28］。

海洋神經(jīng)毒素，不僅對人類的生命安全帶來極大的威脅，還影響了海產(chǎn)品的出口貿(mào)易，對我國沿海城市的經(jīng)濟帶來了損失。鑒于海洋生物體內(nèi)神經(jīng)毒素的脫除對于消費者安全食用具有重大的意義。本文主要對已經(jīng)存在的海洋神經(jīng)毒素的脫除方法進行綜述。

2 海洋生物毒素的脫除技術研究現(xiàn)狀

用Removal of marine neurotoxins(海洋神經(jīng)毒素脫除)為關鍵字，在Web of science中檢索得到圖1和圖2。從圖1可知，近六年內(nèi)關于海洋生物毒素脫除的論文較少，2014年達到高峰(24篇)，其后呈現(xiàn)下降趨勢，近兩年保持在10篇左右的發(fā)表量。從圖2可知，發(fā)現(xiàn)近六年內(nèi)的被引用的文獻逐年增加，說明越來越多的研究者開始關注海洋神經(jīng)毒素脫除方面的工作。

圖1 年份－文章發(fā)表數(shù)Fig.1 Year－Article publications

圖2 年份－文章引用數(shù)Fig.2 Year－Article citation

2.1 物理方法

2.1.1 溫度處理法 Antonio等［29］對染PSP的貽貝、蛤蜊、牡蠣等進行溫度處理，發(fā)現(xiàn)三者所含PSP均從(405±5)mg STXdi HCl－eq./kg減少至350 mg STXdi HCl－eq./kg。而凍融處理后，牡蠣中PSP的含量降低，但蛤蜊中該毒素的含量沒有任何變化。毛丹卉［30］在貝類PSP脫除方法的研究中提到，溫度處理水產(chǎn)品，使其毒素脫除的原理主要是在高溫的環(huán)境中，組織中的毒素可以滲透到體外。不同的組織滲透的速率各不相同。組織松軟的肌肉組織相對于組織僵硬的內(nèi)臟組織更易于將毒素排出到體外。因為蛤蜊毒素主要存在于內(nèi)臟中，使用煮、蒸、炸等烹飪方式進行實驗，發(fā)現(xiàn)均不能將毒素脫除到人類安全食用的水平。

王廣和［31］用5μg/mL的河豚毒素標準品分別放入 50、100、120、150、180、200 ℃下加熱 2 min，發(fā)現(xiàn)120℃以下的溫度處理后，河豚毒素的毒力沒有發(fā)生改變。當溫度達到120℃以上后，其結構發(fā)生了破壞。在后來的實驗中，將58.25μg/g的野生河豚魚用121℃加熱30 min，投喂小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠沒有中毒現(xiàn)象。

2.1.2 暫養(yǎng)脫除法 暫養(yǎng)脫除法是指將在污染水域喂養(yǎng)的水產(chǎn)品放到受監(jiān)控的區(qū)域內(nèi)喂養(yǎng)一段時間，使得其體內(nèi)的毒素達到可以食用的標準(CAC/RCP 52－2003:水產(chǎn)與水產(chǎn)加工品操作規(guī)范)。Bricelj等［32］發(fā)現(xiàn)快中速排毒貝類每天排除率約為15%，慢速排毒貝類的內(nèi)臟在前15 d平均每天排出3.7%，后6 d只有1.2%。研究人員發(fā)現(xiàn)，相對于暫養(yǎng)脫除，投喂餌料藻和使用某些生物脫除劑消除的效果更好。由此可見，暫養(yǎng)脫除法對貝類毒素的消除作用并不顯著。

2.1.3 輻射與輻照處理 位正鵬［33］分別對PSP進行電離輻射和輻照脫除處理。研究發(fā)現(xiàn)用鈷－60對麻痹性貝類毒素照射后，其毒力的改變可以忽略不計。而電子束輻射對PSP照射后，毒力有較為顯著的改變。其中，用電子束在3.2、5.8、8.8 k Gy的劑量下處理，PSP毒力分別降低了15.15%、15.13%、27.22%。根據(jù)輻照后的產(chǎn)物推測，PSP毒力的散失可能是因為其骨架外部的R1～R4基團失去了－H2O和C=O。

2.1.4 活性炭吸附 活性炭被人類廣泛用作吸附劑，尤其是用活性炭吸附裝修后房間內(nèi)的甲醛等有毒有害的氣體。其凈化毒素的原理主要依靠高空隙和比表面積大等造成高輕度吸附力。中國海洋大學團隊使用八種材質(zhì)不同的活性炭對含有PSP的扇貝和貽貝進行毒素脫除。PSP吸附效果受活性炭材質(zhì)的影響。其中，木質(zhì)的活性炭吸附效果最佳，72 h后吸附率為65%。除了玉米穗的吸附效率為48.5%，其余七種活性炭的吸附率均高于50%［34］。在相同的條件下，貽貝與扇貝的脫毒效果有較大的差異，貽貝和扇貝分別用木質(zhì)活性炭處理72 h，發(fā)現(xiàn)貽貝的吸附率高達65%，而扇貝的吸附率為25%，這表明活性炭吸附PSP的效率可能與物種的差異有關。

2.2 化學方法

2.2.1 UV+催化劑系統(tǒng)脫除法 Ali Fakhri［35］使用UV+光催化劑+H2O2系統(tǒng)對TTX進行脫除。實驗發(fā)現(xiàn)催化劑在光催化下具有對TTX的持續(xù)脫除能力和H2O2的良好協(xié)同作用。降解最佳工藝條件如下:pH 5.0，0.15 mmol/L 的 H2O2加入量，10 mg/mL 的初始TTX濃度，0.08 g的催化劑用量和60 min的反應時間。在這些條件下，TTX的去除效率超過90%。TTX的脫除率與催化劑的加入量有關，原因在于隨著反應中涉及的催化劑顆粒的增加，其可以在光下產(chǎn)生更多的活化劑，導致TTX脫除加速。但當添加量超過0.08 g時，催化脫除率呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為過量的催化劑會增加懸浮體系的濁度。這種現(xiàn)象會對紫外線產(chǎn)生明顯的反射和散射效應，從而削弱其穿透能力。這樣，紫外光下催化劑的利用率下降，這導致了 TTX 脫除效率的降低［36－37］。

2.2.2 弱堿脫除 TTX性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水，易溶于酸性溶液，在堿性環(huán)境比較容易被分解，降解為幾種喹啉化合物。毛羽揚［38］分別使用 4%的 Na2CO3、NaOH、半胱氨酸對河豚魚樣進行去毒實驗。在20℃的水溶液中浸泡1 h后，對樣品中的河豚毒素進行提取，取0.5 mL注射小鼠，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠30 min內(nèi)未死亡，出現(xiàn)輕微的癥狀。張松山［39］利用麻痹性貝類毒素在堿性環(huán)境可以脫除的特性，使用食用性蘇打對貝類進行腌制，結果發(fā)現(xiàn)麻痹性貝類毒素脫除效果隨著食用性蘇打的添加而增加。

2.2.3 臭氧、氯氣脫除法 1979年，Blogos－lawski等［40－41］將污染后的蛤蜊放于臭氧處理后的海水中喂養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)蛤蜊的觸角、內(nèi)臟等都表現(xiàn)處理快速排毒的現(xiàn)象。被歐盟委員會唯一授權脫除PSP毒性的方法［41］主要是利用PSP毒素的水溶性，含有PSP的貝類經(jīng)過消毒氯水浸泡后可以降低其毒性。Newcombe［42］發(fā)現(xiàn)，氯水在 pH 6～9 的范圍內(nèi)可以高效地清除毒素。

2.3 生物法

2.3.1 微生物脫除法 賈晉斌［43］利用酒曲對TTX進行脫除。通過小鼠生物法對TTX進行檢測，發(fā)現(xiàn)當加入的TTX的初始濃度為10μg/mL時，在各種條件最優(yōu)化的前提下，培養(yǎng)2 d，注射小鼠，小鼠的死亡的時間為1.5 min;培養(yǎng)6 d，小鼠的死亡時間為20 min。由此可見，酒曲可以降解TTX。而在日本的石川縣，有一種米糠腌制的河豚卵巢作為醬菜，發(fā)現(xiàn)鹽漬一段時間后，河豚魚的卵巢毒性可以忽略不計［44］。

Sugawara［45］是第一位發(fā)現(xiàn)微生物可以脫除貝類毒素的學者。其從水產(chǎn)品的體內(nèi)分離得到了鮑曼不動桿菌和綠膿桿菌，實驗發(fā)現(xiàn)兩者均具有分解GTX1/4、C1/2 毒素的能力。Donovan 等［46］用含有PSP毒素的藍貽貝以及有毒藻的提取物進行培養(yǎng)，其從藍貽貝的內(nèi)臟中分離純化得到了72種微生物，其中19株具有分解PSP的能力。C30、CSC、C100等7株微生物可以脫除90%的毒素。

乳酸菌屬于人體內(nèi)的益生菌，可以幫助排除身體內(nèi)的毒素并可以抑制腸道內(nèi)腐敗菌的滋生提高人體的免疫力。研究人員發(fā)現(xiàn)，益生菌可以幫助海產(chǎn)品脫除PST。Mari Vasama［47］分別用活性和非活性的鼠李糖乳桿菌(ATCC－53103)脫除PST，實驗結果發(fā)現(xiàn)，非活性鼠李糖乳桿菌的脫除效果比活性菌更好。參考以前發(fā)表的一系列霉菌毒素和其底物結合的方式［48－50］，推斷鼠李糖乳桿菌脫除麻痹性貝類毒素可能是結合作用而不是新成代謝作用。PST三維結構圖顯示其呱基上含有兩個正電荷，而鼠李糖乳桿菌表面帶有兩個負電荷，當鼠李糖乳桿菌放入PST溶液中37℃孵育1 h，由于靜電作用，PST與鼠李糖乳桿菌靜電結合，從而達到脫除PST的效果。

2.3.2 酶促脫除法 1981年在線紋布目蛤中發(fā)現(xiàn)了可以轉換PSP的酶，這是第一次發(fā)現(xiàn)酶降解PSP毒素的實例。隨后研究者在其他的蛤中也發(fā)現(xiàn)了具有相同功能的轉換酶［51－52］。Yuko Cho 等［53］在日本蛤蜊和中國蛤蜊中提純到了一種轉化酶，鑒定發(fā)現(xiàn)是氨甲酰水解酶Ⅰ，它不但可以使N－磺酰胺甲酰發(fā)生水解，還可以水解氨基鉀酸酯類毒素亞基。

3 各法的優(yōu)缺點總結

已報道的海洋神經(jīng)毒素脫除方法優(yōu)缺點見表1。溫度處理、活性炭吸附，暫養(yǎng)等方法等雖然操作簡單，但是脫除毒素的效果不佳。溫度的改變只能使貝類部分柔軟的組織中的毒素滲透到體外，而堅硬組織含有的毒素依舊存在體內(nèi)。吸附和暫養(yǎng)法均無法改變毒素的毒力，只是借助于外界，使體內(nèi)的毒素減少。而輻照處理和弱堿降解可以通過改變毒素分子式的結構而導致其活力喪失，脫除效果較佳，但是使用的催化劑和弱堿會使生物的營養(yǎng)價值和風味喪失較多。微生物脫除法的機制還不太確定，可能是新陳代謝的作用，將毒素轉化成另外一種物質(zhì)，也有可能是結合作用。目前的生物方法操作比較復雜，需要進一步的優(yōu)化，使其能夠簡單快捷，適合于工廠操作。

表1 海洋神經(jīng)毒素脫除方法的優(yōu)缺點及適應的比較Table 1 Advantages，disadvantages and adaptations of marine neurotoxin removal methods

4 展望

受海洋生物毒素污染的海產(chǎn)品對人類的健康、經(jīng)濟和生活帶來了威脅。到目前為止，并沒有有效的脫除技術，導致了大量的海產(chǎn)品無法被有效的利用。含有豐富的EPA和DHA的河豚魚肝臟，因為無法脫除河豚毒素而被丟棄。如何利用微生物的分解與發(fā)酵作用，找到一株價格低廉、脫除效果好并且對其品質(zhì)無影響的菌株，還需要進一步的研究。隨著對益生菌的研究，發(fā)現(xiàn)益生菌不僅可以消減小麥、牛奶中的過敏原，還可以脫除堅果中的黃曲霉毒素。在今后的研究中，希望可以篩選出能夠高效脫除海洋生物毒素的益生菌，對原料和成品進行脫毒處理。