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    發(fā)酵液多糖提取方法的研究進展

    2019-01-26 07:44:42徐慧婷張玉國王林平薛文嬌范欣陽王子涵王宏偉
    食品工業(yè)科技 2019年1期
    關(guān)鍵詞:胞內(nèi)發(fā)酵液超臨界

    徐慧婷,王 穎,張玉國,王林平,趙 敏,于 淼,薛文嬌,范欣陽,王子涵,王宏偉,*

    (1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150040;2.長白山森工集團,吉林延吉133000)

    多糖是一種廣泛分布于自然界的生物高分子,由于其能改變水的液流性,常作為增稠劑應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域;由于多糖作為免疫系統(tǒng)的組成部分,能有效增強免疫力,是醫(yī)藥研究的重要方向之一。動物、植物、微生物都可以合成自身的多糖,動物植物多糖的生產(chǎn)多局限于地區(qū)和氣候等自然問題且培養(yǎng)成本高昂,微生物多糖的發(fā)展受地區(qū)氣候限制較少,培養(yǎng)成本較少,利于其工業(yè)化大批量的生產(chǎn)加工;且微生物生存環(huán)境各異,產(chǎn)生的多糖種類較多,部分多糖利用價值高于動植物多糖,如右旋糖酐作為血漿代用品;黃單胞桿菌產(chǎn)生的黃原膠作為食品添加劑;葡聚糖對吞噬細胞的積極作用,有效增強免疫力。由于微生物多糖的作用價值漸漸被發(fā)現(xiàn),其提取工藝的研究顯得尤為重要。微生物發(fā)酵液內(nèi)成分比較復(fù)雜,含有微生物和胞外代謝物質(zhì)[1]。發(fā)酵液內(nèi)的多糖成分具有抗氧化[2-5]、抗腫瘤[6-8]、抗衰老[9-10]等活性,具有醫(yī)用價值和商業(yè)價值[11],所以其提取工藝的研究有很大意義,故本文對近年來的發(fā)酵液多糖的提取方法進行了概述。

    1 發(fā)酵液多糖定義與分類

    發(fā)酵液多糖是指由微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的碳水化合物。按多糖存在位置分,可分為胞內(nèi)多糖和胞外多糖兩類[1]。胞內(nèi)多糖存在于細胞內(nèi)的質(zhì)膜表面或內(nèi)部以儲存能量,胞內(nèi)多糖作為儲能物質(zhì)分子量較大,不易穿過細胞[12]。胞外多糖是在生長代謝過程中分泌到胞外環(huán)境中(附著在細胞表面和分泌在培養(yǎng)基)或通過胞外分泌酶合成的一類分子量較小的多糖,較小的分子量利于穿過細胞膜分泌到細胞外[13-15]。胞內(nèi)多糖與胞外多糖由于功能不同以及存在位置不同,兩者結(jié)構(gòu)的差異主要在于分子量差異與單糖組分差異[16]。大多數(shù)提取發(fā)酵液多糖實驗直接將胞內(nèi)多糖與胞外多糖一起提取,但由于胞內(nèi)多糖與胞外多糖活性不同,部分實驗采取分開提取。從方法上來看,由于胞外多糖大部分存在于液體培養(yǎng)基,胞外多糖提取只需要作用于液體培養(yǎng)基;胞內(nèi)多糖由于存在于細胞內(nèi)部,需要多一步細胞破碎,使胞內(nèi)多糖游離到細胞外。細胞破碎過程中可能會導(dǎo)致部分多糖被破壞,所以是胞內(nèi)多糖提取過程較重要的一步。

    2 發(fā)酵液多糖的提取方法

    史美麗等[17]通過比較灰樹花不同階段發(fā)酵液多糖的含量得出,發(fā)酵液多糖有胞內(nèi)多糖和胞外多糖之分;且不同時期胞內(nèi)多糖和胞外多糖含量不同,說明發(fā)酵液多糖的提取時期隨主要提取物質(zhì)不同應(yīng)有所調(diào)整。

    2.1 發(fā)酵液胞外多糖的提取方法

    發(fā)酵液的胞外多糖多存在于液體培養(yǎng)基中,少量存在于微生物細胞內(nèi),常用的提取方法為水提法,由于部分發(fā)酵液中含有水,可直接取發(fā)酵液的液體部分,濃縮干燥,得到粗多糖。水提法原理在于多糖能溶于水,所以提取過程只需要水浸泡,成本低廉,對設(shè)備要求低、操作簡單,但是耗時且純度低,所以常用一些輔助手段輔助水提法。比如通過有機溶劑沉淀法、脈沖電場處理以及超聲波處理。

    2.1.1 有機溶劑沉淀法 多糖是生物高分子,溶于水溶液而不溶于有機溶劑,所以可用有機溶劑作為沉淀劑輔助水提法提取。該方法提取原理是:有機溶劑濃度的改變會導(dǎo)致溶液中介電常數(shù)變化,介電常數(shù)的降低使多糖溶解度降低,從而沉淀出來[18]。所以有機溶劑的介電常數(shù)越低,應(yīng)該越利于多糖的沉淀,丙酮介電常數(shù)小,沉淀多糖能力強,也常作為沉淀劑;乙醇無毒且介電常數(shù)較小,多使用乙醇為沉淀劑。

    有機溶劑沉淀法關(guān)鍵在于溶劑。例如張濤等[19]在單因素試驗中用體積分?jǐn)?shù)不同的乙醇沉淀發(fā)酵液,發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度較低時,得到的主要是大分子多糖和雜蛋白;乙醇濃度較高時,得到的是小分子多糖,可能是由于多糖分子與醇溶蛋白的結(jié)合。閆訓(xùn)友等[18,20]通過正交試驗考察了乙醇沉淀法的溫度、濃度、時間三因素對提取率的影響,最佳工藝中要優(yōu)先考慮溫度因素。閆訓(xùn)友等[20]在乙醇法提取阿魏側(cè)耳發(fā)酵液多糖試驗中得到溫度過高會導(dǎo)致多糖裂解,結(jié)構(gòu)變化,溶劑滲透能力和溶解能力有所增強。

    有機溶劑沉淀法是利用有機溶劑改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)以沉淀多糖,溶劑的介電常數(shù)影響提取率,應(yīng)選用合適的溶劑提取,過程中關(guān)鍵在于溶劑,所以成本較低,操作較簡單。

    2.1.2 幾種新型提取法 目前胞外多糖的提取雖然還是以有機溶劑沉淀法為主,但是隨著胞外多糖的發(fā)展,也漸漸出現(xiàn)了幾種新型的提取方法,只是相關(guān)研究較少。

    高壓脈沖電場法就是在水提法和有機溶劑沉淀法工藝基礎(chǔ)上加上脈沖電場輔助提取,用高壓脈沖電場處理含有微生物的發(fā)酵液,可能使附著在微生物表面的胞外多糖脫落,游離于發(fā)酵液中,可有效提高多糖提取率,更具經(jīng)濟效益,但可能會破壞多糖分子的完整性。張鐵華等[21]通過高壓脈沖電場處理后提取的多糖含量較傳統(tǒng)提取法提高了84.30%,且耗時短、耗能低、效率高。多糖提取率隨電場強度增大先升高后降低,可能是由于電場強度過大,導(dǎo)致多糖分子斷裂。

    超聲波提取法提取胞外多糖是通過超聲波處理微生物發(fā)酵液輔助提取,超聲波處理產(chǎn)生的空化作用,熱效應(yīng)以及機械振動作用更利于微生物表面多糖的脫落、溶解,可有效提高多糖提取率,有效縮短提取時間。李堆淑[22]的超聲波輔助乙醇沉淀法提取黃鏈霉菌胞外多糖的單因素試驗中,超聲波功率的升高導(dǎo)致胞外多糖濃度先增高后下降,可能是由于超聲波功率過高導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞。

    2.2 發(fā)酵液胞內(nèi)多糖的提取方法

    發(fā)酵液的胞內(nèi)多糖多存在于微生物細胞內(nèi),所以提取時需要將微生物與發(fā)酵液分離,然后破碎微生物細胞。傳統(tǒng)水提法即通過水浸泡使細胞破裂,對提取物質(zhì)損害少,但提取效率較低,最簡易的破碎細胞方法即人工粉碎微生物細胞,現(xiàn)多采用高壓脈沖、微波、超聲波、酶等輔助破碎細胞。

    2.2.1 溶劑提取法 水或者有機溶劑加入物料中浸泡、提取的方法是目前提取多糖最常用的。一般都采取熱水進行浸泡提取,還有個別原材料需要加入一些弱酸或弱堿,才能提取出其中的多糖物質(zhì),而液體原料僅需要加入乙醇等有機溶劑進行直接沉淀提取多糖。固體原料在水提后還需要用乙醇沉淀提?。?3]。

    溶劑提取法的關(guān)鍵在于溶劑的選擇。孫居民等[24]通過研磨破碎金針菇菌絲體后用熱水提取,最后用乙醇沉淀。試驗通過提取液與95%乙醇不同體積比提取,得到加入3倍乙醇最適合。李羿等[25]通過堿提取法對茯苓堿溶性胞內(nèi)多糖的提取工藝的提取溫度和堿性溶液濃度進行了單因素實驗,得出隨著溫度的升高,堿溶性多糖提取率減少,堿性多糖提取率隨著NaOH濃度升高先升高后降低,實驗得到NaOH最佳提取濃度為1.0 mol/L。

    通過加入溶劑使溶液中多糖溶解度改變,使多糖沉淀出來,也有可能沉淀出蛋白質(zhì)等雜質(zhì),所以純度不高;過程只需人工破碎微生物、添加溶劑沉淀多糖,所以操作簡單、對設(shè)備要求不高、成本低廉。

    2.2.2 高壓脈沖提取法 高壓脈沖可使細胞膜電位發(fā)生變化,膜通道打開,細胞內(nèi)外物質(zhì)交換,滲透不均勻性瞬間使細胞破碎,組織流出[26]。高壓脈沖可在相對低的溫度和較短時間內(nèi)破碎細胞,且能耗較低[27],適于多糖的提取。

    高壓脈沖能在短時間內(nèi)破碎細胞,張若兵等[28]利用雙熒光染色法以及流式細胞儀量化了高壓脈沖對小球藻細胞的破碎效果,電場強度與脈沖注入能量密度越高,細胞破碎效果越好且耗時短。殷涌光等[29]通過比較高壓脈沖電場提取法(49.8%)、熱堿提取法(29.8%)、微波輔助提取法(44.2%)和超聲波輔助提取法(51.2%)提取樺褐孔菌多糖的提取率,發(fā)現(xiàn)高壓脈沖提取法的提取率僅次于超聲波提取法;又通過比較高壓脈沖電場提取法(25.6%)、熱堿提取法(22.4%)、微波輔助提取法(20.5%)和超聲波輔助提取法(18.3%)提取樺褐孔菌多糖的純度,發(fā)現(xiàn)高壓脈沖提取法提取率是超聲波輔取法的1.40倍,脈沖電場輔助提取所得多糖雜質(zhì)較少,純度較高。馬鳳鳴等[30]通過脈沖電場法提取黑木耳多糖提取率(8.86%)高于超聲波處理輔助(7.24%)提取率,說明脈沖法破壁效果較好,且脈沖電場法(0.0024 J/g)提取多糖能量消耗較超聲波法(7.2661 J/g)也少。

    通過高壓脈沖產(chǎn)生膜穿孔來破碎細胞,能在瞬間破碎細胞,耗時短;需要高壓脈沖系統(tǒng),與超臨界流體萃取法和亞臨界水提取法相比成本較低,設(shè)備普遍性高,使用較簡單。破碎過程中溫度快速升高[31],節(jié)省加熱過程,不利熱敏性多糖的提取。

    2.2.3 酶提取法 酶法提取法的原理是通過酶對細胞壁、細胞膜和細胞質(zhì)膜的酶解作用,使細胞內(nèi)物質(zhì)獲得最大程度的釋放[32]??膳c溶劑沉淀法一起使用,酶可以溫和分解細胞,加速胞內(nèi)多糖釋放提取,提取效率較溶劑法明顯提高。由于酶的專一性和選擇性,應(yīng)該用不同的酶對不同底物作用以提高提取率[33],所以復(fù)合酶作用比單一酶作用提取率高[34]。

    酶法提取多使用混合酶提取,且一定程度上可以減少蛋白雜質(zhì)。陳娜[35]的靈芝發(fā)酵液多糖提取試驗中,酶法輔助提取(2.35%)靈芝胞內(nèi)多糖提取率明顯高于熱水提取法(1.78%)。藺紅蘋等[36]通過試驗比較了堿法、酸堿法和酶堿法提取啤酒酵母細胞壁中葡聚糖的提取率,得到多糖提取率最低的為堿法,最高的為酶堿法(73.67%),且純度較高,蛋白雜質(zhì)酶堿法(8.16%)較堿法(15.28%)和酸堿法(12.43%)明顯減少,證明了酶法輔助提取除了提取率高以外,還能降低提取液內(nèi)的蛋白雜質(zhì)。劉寧和李?。?7]通過酶提取法提取香菇多糖,使用混合酶提取香菇多糖的提取率比水提法高出6.26%,在時間上縮短了2/3,且雜質(zhì)含量較少。

    通過酶反應(yīng)來破碎細胞,優(yōu)點在于酶促反應(yīng)溫和,適于不能經(jīng)歷激烈反應(yīng)物質(zhì)的提取,不會破壞多糖成分,多糖活性較高。酶促反應(yīng)破碎細胞效率遠高于水提法,耗時短且能耗低。但是選擇到合適的酶有困難,且部分酶不好回收,容易引入雜質(zhì)。

    2.2.4 超聲波提取法 超聲波是一種頻率高于20000 Hz的聲波,作用于液體時產(chǎn)生空化作用,液體內(nèi)小氣泡產(chǎn)生并膨脹,并突然破碎,產(chǎn)生瞬間高溫高壓,一定的沖擊波和高速射流破碎細胞;超聲波產(chǎn)生的機械振動和熱效應(yīng)利于物質(zhì)溶出[38-39]。

    超聲波能較為高效地破碎細胞,利于多糖的提取,但也存在破壞多糖結(jié)構(gòu)的問題。Simon Bystryak等[40]通過超聲波破碎釀酒酵母細胞實驗,得出超聲波破碎細胞效率高于高壓破碎和珠磨破碎,且能更有效地使物質(zhì)與膜分離,利于提取與膜結(jié)合的多糖。胡小軍[41]通過正交試驗設(shè)計確定了超聲時間是影響多糖得率的最關(guān)鍵因素。多糖得率隨超聲波時間的增加而升高,達到最大值后不再出現(xiàn)明顯升高,且長時間作用會使部分多糖由于超聲波的機械作用而斷裂,結(jié)構(gòu)被破壞,得率反而下降[42]。吳霞等[43]通過提取阿里紅多糖證明了超聲波提取法(1.01%)較常規(guī)熱水提法(0.81%)得率高且耗時短,是比較可取的具有經(jīng)濟效益的提取方法。

    超聲波輔助產(chǎn)生的空化作用、熱效應(yīng)和機械作用是影響提取率的主要原因,空化作用能產(chǎn)生極大壓力,瞬間破碎細胞,耗時短且能耗低,熱效應(yīng)和振動機械作用會加速胞內(nèi)物質(zhì)釋放、溶解,利于提高多糖得率。由于超聲波法理想溫度在40~60℃,對熱敏感分子損害較?。?4],利于熱不穩(wěn)定多糖的提取。且超聲波設(shè)備較為普遍,設(shè)備操作簡便,成本較低,具有經(jīng)濟效益。

    2.2.5 微波提取法 微波是頻率在300 MHz~300 GHz的電磁波。微波能直接作用于細胞內(nèi)部,由于細胞內(nèi)水分含量較高,能快速被加熱,高溫使內(nèi)壓過大導(dǎo)致細胞破碎,形成孔洞,溶劑進入細胞,溶解并釋放多糖物質(zhì)[45-46],是較理想的多糖提取方法。

    微波能促進細胞破裂以及多糖物質(zhì)的溶出,減少提取時間,利于多糖提取。樊黎生等[47]通過微波輔助水提法(13.26%)提取黑木耳多糖得率比常規(guī)水提法的得率提高約51%,且提取時間縮短了大半,說明了微波提取法具有提取率高耗時短的優(yōu)點。章銀良等[48]微波預(yù)處理和水提法提取發(fā)酵細胞多糖實驗中,酵母細胞內(nèi)含有海藻糖酶,可以降解海藻糖,影響發(fā)酵細胞多糖提取,而微波可以使海藻糖酶迅速失活,利于發(fā)酵細胞的多糖提取。

    微波提取法是通過微波產(chǎn)生熱量,加熱體系促進有效物質(zhì)的釋放溶解,較水提法耗時短提取率高。微波在極性溶劑下才能釋放能量加熱溶液,需要極性溶劑作為介質(zhì)。由于微波的加熱,部分多糖結(jié)構(gòu)會破壞,影響多糖活性。多數(shù)實驗室具備微波相關(guān)設(shè)備操作簡單,成本不高。

    2.2.6 超臨界流體萃取法 超臨界流體是溫度和壓力都超過臨界值的高密度流體,狀態(tài)處于氣體和液體之間,通過改變溫度和壓力導(dǎo)致密度發(fā)生較大變化,也就是說其溶解能力也會隨之改變,可作為溶劑提取目標(biāo)物質(zhì)[49]。超臨界流體萃取是目前較前沿的方法之一。

    超臨界流體具有高溶解能力和高滲透能力利于多糖的提取。樊黎生等[47]通過超臨界萃取法提取黑木耳多糖得到的提取率(16.82%)高于微波輔助萃取法(14.05%)和超聲波萃取法(15.43%)。張素霞[50]通過超臨界CO2輔助提取法和傳統(tǒng)熱水提取法提取香菇多糖,超臨界輔助法的多糖提取率比傳統(tǒng)方法高3.16%,耗時是傳統(tǒng)方法的1/5,可能由于超臨界流體的高溶解能力和高滲透能力促使提取耗時短。較之于酸堿溶劑法和酶法,超臨界流體分離較為方便,減少雜質(zhì)污染。

    超臨界萃取法就是利用超臨界流體的高滲透能力和高溶解能力實現(xiàn)萃取[51],耗時較傳統(tǒng)方法較短。超臨界流體由于其特殊狀態(tài),較其他常規(guī)萃取劑而言更易分離,能實現(xiàn)無溶劑殘留,不對產(chǎn)物產(chǎn)生污染,且超臨界流體可以反復(fù)利用,降低了成本。操作溫度較低,比如常用的超臨界流體CO2的臨界溫度是31.1℃,對有效物質(zhì)的損害較小,利于熱敏感性、易氧化物質(zhì)的提取與分離。常用的CO2萃取劑對環(huán)境無害,可以稱之為綠色無污染的工藝,只是該工藝設(shè)備較復(fù)雜,成本較其他方法高,使用不是很廣泛。

    2.2.7 亞臨界水提取法 亞臨界水提取法是目前研究較多的方法之一,由于萃取劑為對環(huán)境無害的水,其綠色無污染日益受研究者關(guān)注。亞臨界水即溫度高于沸點100℃低于臨界溫度374℃的在外加壓力下,仍然保持液態(tài)的水,此時這種溶液介電常數(shù)和極性發(fā)生變化,溶解能力增大,性質(zhì)近似有機溶劑[52-53],較適合提取中極性和非極性有機化合物,對低極性化合物溶解度很低[54-55],且提取的多糖產(chǎn)量高,活性高[56]。

    水達到亞臨界水狀態(tài)溶解度增大,利于多糖物質(zhì)的釋放溶出。程斌[57]在亞臨界水萃取金針菇中多糖研究中提取率為5.21%,證明了亞臨界水萃取法提取多糖的可行性,且具有耗時短、提取率高的優(yōu)點。包怡紅等[58]用亞臨界水提取法(24.23%)提取黑木耳多糖,與水浸法[59](5.03%)、酶提取法[60](9.95%)、微波輔助法[61](16.24%)、超聲波輔助法[62](16.32%)相比較,亞臨界水提取法提取率最高。

    表1 不同發(fā)酵液胞內(nèi)多糖提取方法的比較Table 1 Comparison of extraction methods of fermentation liquid intracellular polysaccharides

    亞臨界水提取是利用亞臨界狀態(tài)的水極性大大降低,從而對有效物質(zhì)進行提取,由于溶劑為亞臨界水,避免了有害物質(zhì)以及雜質(zhì)的殘留,綠色無污染,這種提取方法清潔,快速,高效,可以實現(xiàn)自動化[63]。但是亞臨界水提取裝置較為復(fù)雜,適用范圍不是很廣泛。表1比較了發(fā)酵液胞內(nèi)多糖的不同提取方法的優(yōu)缺點和適用情況。

    3 總結(jié)與展望

    發(fā)酵液多糖提取通常是指胞內(nèi)多糖與胞外多糖同時提取,此時與胞內(nèi)多糖提取的不同在于不用將微生物細胞與發(fā)酵液分離,方法同發(fā)酵液胞內(nèi)多糖的提取方法。提高胞外多糖的提取率的關(guān)鍵在于微生物表面多糖的脫落溶解量,通過水浸泡、高壓脈沖以及超聲波等手段可以促使附著在微生物表面多糖溶解,利于多糖分離,在通過有機溶劑沉淀法能得到更純的多糖產(chǎn)物。提高胞內(nèi)多糖或發(fā)酵液多糖提取率的關(guān)鍵在于微生物細胞的破碎,通過酶降解、高壓脈沖、超聲波、微波處理輔助細胞破碎,使多糖更易釋放溶解。現(xiàn)在討論較多的超臨界流體萃取法和亞臨界水提取法都是利用壓力與溫度的改變使溶劑的溶解度改變,從而利于多糖的溶解,這兩種方法所用溶劑較易與有效成分分離且無毒害,適用于對安全性要求較高物質(zhì)的分離,且這兩種方法的溶劑對環(huán)境沒有危害,較為綠色環(huán)保,在提倡綠水青山的新時代有較大的發(fā)展價值。

    如今發(fā)酵液多糖的價值特別是藥用價值正漸漸被發(fā)現(xiàn)、重視,其提取工藝的優(yōu)化就顯得尤為重要,一種適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)的方法正等待著被發(fā)現(xiàn)?,F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提取多糖主要還是采用溶劑提取法,耗時長且料液比高,經(jīng)濟效益不高,而其他輔助法多還停留在實驗室階段,目前高壓脈沖、超聲波、酶解、微波已經(jīng)漸漸應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,有關(guān)裝置以及工藝專利較多,但多是有關(guān)植物油或多酚的提取,發(fā)酵液多糖方面還有很大發(fā)展空間;超臨界流體萃取法和亞臨界水提取法相關(guān)工藝歐美已經(jīng)開始應(yīng)用于工業(yè)化咖啡豆的脫咖啡因,國內(nèi)的超臨界流體萃取法和亞臨界水提取法相關(guān)工藝在裝置上仍有一定的差距,隨著人們對環(huán)境保護的重視,由于這兩種方法綠色環(huán)保的特點,他們的工業(yè)化將具有深刻長遠意義和廣闊的發(fā)展前景。希望這些提取工藝能早日應(yīng)用于實際工業(yè)化生產(chǎn)中,創(chuàng)造經(jīng)濟效益;發(fā)酵液多糖的抗癌抗菌等活性能早日應(yīng)用于醫(yī)藥方面,為人類健康造福。

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