酸性染料比色法測定燕麥中總生物堿含量條件優(yōu)化

王晶晶，孫 敏，宋詩清，馮 濤，姚凌云

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海201418)

燕麥(Avena sativa L.)是目前唯一的全谷物進(jìn)食、有益健康的食品［1］。燕麥的高營養(yǎng)價值不僅表現(xiàn)在其富含蛋白質(zhì)、油脂、膳食纖維等營養(yǎng)成分，更重要的是富含多種抗氧化、降血脂等作用的生物活性物質(zhì)［2－4］。其中，燕麥生物堿(Avenanthramides) 是一類獨特的含氮酚酸類衍生物［5－6］，兼有抗炎、抗增殖和止癢等生物活性［7－10］，在食品、藥物和化妝品等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用［1，11－12］。因此，建立燕麥總生物堿的檢測方法十分有必要。

目前，國內(nèi)外在燕麥生物堿的提取、分離及生物活性方面已有大量研究，而燕麥中總生物堿含量的測定方法鮮見報道。文獻(xiàn)中對于燕麥生物堿含量的檢測，主要采用 HPLC 法［13－16］，即通過與合成的燕麥生物堿標(biāo)準(zhǔn)品比對，對燕麥生物堿進(jìn)行分析鑒定。HPLC雖有分離效果好、精密度高等優(yōu)點，但所需標(biāo)準(zhǔn)樣品的單體復(fù)雜不易得，目前尚未有商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品，因此該法的廣泛應(yīng)用受到限制。酸性染料比色法具有較好的專屬性和精密度，靈敏度高，簡便易行，是測定總生物堿含量的經(jīng)典方法之一，近年來在生物堿的檢測中應(yīng)用較多。曾王旻等［9］采用了中國藥典中測定總生物堿的通用方法來測定燕麥總生物堿含量，該法以小檗堿作為對照，其與蒽酰胺的結(jié)構(gòu)差距較大，可能會導(dǎo)致測定結(jié)果不夠精確，同時未優(yōu)化燕麥生物堿的測定條件。

曲尼司特(Tranilast)具有與燕麥生物堿相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和紫外吸收特征，可作為一個較好的對照品用于燕麥蒽酰胺類物質(zhì)的定量測定［17］。本研究以曲尼司特為標(biāo)準(zhǔn)品對照，采用酸性染料比色法針對性地測定燕麥總生物堿含量。通過對酸性染料比色法的染料種類、緩沖溶液種類和酸性染料用量的系統(tǒng)考察，建立了燕麥中總生物堿含量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥 上海谷子地生物技術(shù)有限公司提供;曲尼斯特 阿拉丁試劑有限公司。

DHG－9140電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;ML 104/02電子天平 上海梅特勒－托利多儀器有限公司;FE20 Plus實驗室p H計 上海梅特勒－托利多儀器有限公司;SK5200BT超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;UV2350型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;TGL－16M臺式高速冷凍離心機 長沙高新技術(shù)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗溶液的制備

1.2.1.1 對照品的選擇 由于燕麥生物堿的結(jié)構(gòu)與臨床抗組胺及抗炎藥物曲尼司特(Tranilast)的結(jié)構(gòu)非常相似(見圖1)，因此選曲尼司特作為對照品［17］。

圖1 三種主要燕麥生物堿及曲尼司特結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the three major avenanthramides and Tranilast

1.2.1.2 燕麥總生物堿供試品溶液的制備 將燕麥顆粒用粉碎機粉碎后過80目篩，備用。取粉碎過篩后的燕麥粉末10 g，加入80%的乙醇溶液350 mL置于超聲裝置(480 W，60℃)中提取兩次，每次30 min，提取之后過濾，合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空濃縮(－0.1 MPa，45℃)定容至50 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

1.2.2 酸性染料比色法試驗條件的確定

1.2.2.1 酸性染料比色法最大吸收波長的掃描 精密吸取15.3 mg/L曲尼斯特溶液2.0 mL，置于分液漏斗中，加入5.0 mL p H為5.4的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，再加入溴甲酚紫染料2.5 mL，搖勻，加入5.0 mL二氯甲烷溶液進(jìn)行萃取，振搖3 min，靜置30 min，重復(fù)萃取三次，直至二氯甲烷層無色，合并二氯甲烷溶液并加入0.5 g無水硫酸鈉，放置30 min，作為離子對提取溶液，以二氯甲烷溶液為空白對照，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。

1.2.2.2 酸性染料種類的選擇 精密吸取2.0 mL供試品溶液置于分液漏斗中，加入5.0 mL pH為5.4的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，各取溴甲酚綠、溴甲酚紫、溴百里香酚藍(lán)酸性染料溶液2.5 mL，搖勻，加入5.0 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，振搖3 min，靜置30 min，重復(fù)萃取三次，直至二氯甲烷層無色，合并二氯甲烷溶液并加入0.5 g無水硫酸鈉，放置30 min，作為離子對提取溶液組，以二氯甲烷溶液作為空白對照，在340 nm進(jìn)行吸光度測定。

1.2.2.3 緩沖溶液的選擇 精密吸取2.0 mL供試品溶液置于分液漏斗中，加入5.0 mL pH為5.4的乙酸－乙酸鈉、磷酸二氫鈉－氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀－氫氧化鈉緩沖溶液，再加入溴甲酚紫溶液2.5 mL，搖勻，加入5.0 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，振搖3 min，靜置30 min，重復(fù)萃取三次，直至二氯甲烷層無色，合并二氯甲烷溶液并加入0.5 g無水硫酸鈉，放置30 min，作為離子對提取溶液組，以二氯甲烷溶液作為空白對照，在340 nm處進(jìn)行吸光度測定。

1.2.2.4 酸性染料用量的選擇 精密吸取2.0 mL供試品溶液置于分液漏斗中，加入5.0 mL pH為5.4的磷酸二氫鈉－氫氧化鈉緩沖溶液，再加入溴甲酚紫溶液2.5 mL，搖勻，加入5.0 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，振搖3 min，靜置30 min，重復(fù)萃取三次，直至二氯甲烷層無色，合并二氯甲烷溶液并加入0.5 g無水硫酸鈉，放置30 min，作為離子對提取溶液組，以二氯甲烷溶液作為空白對照，在340 nm處進(jìn)行吸光度測定。同方法測定溴甲酚紫染料用量為1.5、2.0、3.0、3.5、4.0 mL時的吸光值。

1.2.3 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取153 mg/L的曲尼司特溶液，采用無水乙醇稀釋成濃度為0.306、1.53、3.06、4.59、6.12、15.3、30.6、45.9 mg/L 的稀釋液，各稀釋液均加入p H為5.4的磷酸二氫鈉－氫氧化鈉緩沖溶液5.0 mL，再加入溴甲酚紫3.0 mL，搖勻，加入二氯甲烷5 mL，振搖3 min，靜置30 min，重復(fù)萃取三次，直至二氯甲烷層無色，合并二氯甲烷溶液并加入0.5 g無水硫酸鈉，放置30 min，以二氯甲烷溶液作為空白對照，于340 nm處測定吸光度。以曲尼斯特濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 燕麥總生物堿的測定 精密吸取一定體積提取液，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法測定吸光度，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得燕麥生物堿質(zhì)量濃度c(mg/L)，則燕麥生物堿得率為:

式中:c－根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出的燕麥生物堿的質(zhì)量濃度(mg/L);D－稀釋倍數(shù);V－原提取液的體積(L);m－燕麥粉末質(zhì)量(g)。

1.2.3.3 精密度試驗 精密吸取15.3 mg/L曲尼司特標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0 mL置于分液漏斗中，其余步驟按“1.2.3.1”法操作，連續(xù)測定6次，記錄吸光度。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一燕麥總生物堿提取液 2.0 mL，分別在 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h按“1.2.3.1”法于340 nm處測定吸光度，記錄吸光度。

1.2.3.5 重現(xiàn)性試驗 取同一批次的燕麥粉末6份，每份10 g，均按照供試品制備項下方法制備，精密吸取供試液2.0 mL置于分液漏斗中，其余步驟按“1.2.3.1”法操作，平行測定6次吸光度值，記錄吸光度。

1.2.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取6份已知濃度的供試品溶液1.0 mL(10.8347 mg/L)，分別加入不同濃度的曲尼司特溶液1.0 mL(表1)，混勻，其余步驟按“1.2.3.1”法操作，并于340 nm下測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算加樣回收率:

加樣回收率(%)=(加標(biāo)試樣測定值－試樣測定值)×100/加標(biāo)量

1.3 數(shù)據(jù)與處理

采用ChemDraw軟件繪制化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。若無特別說明，實驗數(shù)據(jù)為3次平行實驗的平均值，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示，所得數(shù)據(jù)利用Origin 9.0繪制各個因素的動力學(xué)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性染料比色法測定條件的選擇

2.1.1 最大吸收波長的確定 試驗結(jié)果如圖2所示，酸性染料與曲尼司特溶液在340 nm處形成最大吸收波長的穩(wěn)定絡(luò)合物，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果類似［17］，因此選擇340 nm作為生物堿測定的檢測波長。

2.1.2 酸性染料種類的確定 不同酸性染料與燕麥生物堿結(jié)合的最大吸光度有所不同(圖3)。其中，溴甲酚紫與供試品溶液形成的離子對在340 nm處有最大吸光度值，其次為溴百里香酚藍(lán)和溴甲酚綠。溴百里香酚藍(lán)在300～500 nm范圍內(nèi)有紫外吸收，會對檢測造成較大干擾［18］。本試驗中溴百里香酚藍(lán)乙醇溶液紫外掃描結(jié)果與文獻(xiàn)［18］報道一致，其波峰和波谷分別在370 nm和335 nm(圖4)，波谷位置與曲尼司特的波峰340 nm(圖2)接近，這可能會導(dǎo)致曲尼司特和溴百里香酚藍(lán)形成絡(luò)合后紫外吸收的下降(圖3)，因而不宜用作燕麥生物堿測定的染料。另外，溴甲酚紫比溴甲酚綠更加經(jīng)濟實惠，因此綜合考慮，將酸性染料確定為溴甲酚紫。

圖2 對照品溶液的紫外－可見吸收圖譜Fig.2 UV－visible absorption spectra of reference solution

圖3 不同酸性染料對燕麥生物堿溶液吸光度的影響Fig.3 Effect of different acid dyes on absorbance of total avenanthramides solution

圖4 溴百里香酚藍(lán)紫外－可見吸收圖譜Fig.4 UV Vis absorption spectra of bromothymol blue

2.1.3 緩沖溶液的確定 不同緩沖體系對燕麥總生物堿含量測定的吸光度有所影響，但磷酸二氫鈉－氫氧化鈉緩沖溶液的離子對吸光度最大(圖5)，因此選擇磷酸二氫鈉－氫氧化鈉溶液作為后續(xù)實驗的緩沖溶液。

圖5 不同緩沖溶液對燕麥總生物堿溶液吸光度的影響Fig.5 Effect of different buffer solutions on absorbance of total avenanthramides solution

2.1.4 酸性染料用量的確定 試驗所用酸性染料的用量對結(jié)果具有一定的影響，不同的酸性染料用量，具有不同的吸光度值(圖6)。在1.5～3.0 mL范圍內(nèi)增加酸性染料用量時，吸光度值逐漸增大，之后再增加酸性染料用量，吸光度值反而減小。這可能是因為酸性染料用量約為3.0 mL時已經(jīng)與燕麥生物堿完全結(jié)合，生物堿被充分萃取，吸光度達(dá)到最大。繼續(xù)增加酸性染料用量時，空白溶液顏色呈加深現(xiàn)象，這可能對測量結(jié)果造成一定的干擾，使吸光度下降(圖6)。因此最佳的酸性染料用量選擇3.0 mL。

圖6 緩沖溶液的不同用量對燕麥總生物堿吸光度的影響Fig.6 Effect of different dosage of buffer solution on absorbance of total avenanthramides solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與燕麥總生物堿的檢測

2.2.1 曲尼司特標(biāo)準(zhǔn)曲線 試驗結(jié)果如圖7所示，經(jīng)試驗數(shù)據(jù)處理，得曲尼司特標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度與濃度之間的回歸方程為y=0.04837x+0.00822(x表示溶液濃度，y表示吸光度值)，R2=0.9994。結(jié)果表明，燕麥生物堿含量在0.306～45.9 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖7 曲尼司特標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of tranilast

2.2.2 燕麥總生物堿的測定 根據(jù)以上篩選的結(jié)果，供試品(2 mL)中總生物堿的測定條件為:染料溴甲酚紫(3 mL)，p H5.4的磷酸二氫鈉－氫氧化鈉緩沖溶液，檢測波長340 nm。在此條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制法測定出供試品的吸光度并計算燕麥生物堿質(zhì)量濃度c(mg/L)。燕麥生物堿的得率按照“1.2.3.2”中的公式計算，最終結(jié)果為(48.63±1.02)mg/kg(n=3)。

2.3 精密度試驗

精密吸取15.3 mg/L曲尼司特對照品溶液2.0 mL置于分液漏斗中，其余步驟按“1.2.3.1”法操作，連續(xù)測定6次，測得RSD=0.12%，小于2%，表明精密度符合要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一燕麥總生物堿提取液2.0 mL，分別在0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 按“1.2.3.1”法于340 nm處測定吸光度，結(jié)果RSD=1.26%，表明供試品溶液在3.0 h內(nèi)基本穩(wěn)定(注意保持裝置的氣密性良好)。

2.5 重現(xiàn)性試驗

取同一批次的燕麥粉末6份，每份10 g，均按照供試品制備項下方法制備，精密吸取供試液2.0 mL置于分液漏斗中，其余步驟按“1.2.3.1”法操作，平行測定6次吸光度值，RSD=0.031%，表明實驗方法重現(xiàn)性良好，符合含量測定要求。

2.6 加樣回收率試驗

精密吸取6份已知濃度的供試品溶液1 mL(10.8347 mg/L)，分別精密加入一定量的曲尼司特溶液(表1)，混勻，其余步驟按“1.2.3.1”法操作，并于340 nm下測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算回收率，結(jié)果見表1，該方法回收率在92.28%～96.53%之間，其平均回收率為94.22%，RSD=1.79%(n=6)，說明該方法具有比較良好的回收率。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果Table 1 Result of the recovery test

3 結(jié)論與討論

本試驗采用酸性染料比色法檢測燕麥總生物堿含量，研究了影響酸性染料比色的幾個因素，最終確定了最佳條件:酸性染料為溴甲酚紫，緩沖溶液為p H為5.4的磷酸二氫鈉－氫氧化鈉，酸性染料用量為3 mL。試驗結(jié)果表明，該方法具有較好的專屬性和精密度，靈敏度高，簡便易行，是測定燕麥總生物堿含量的一種方法。本方法與曾王旻等［19］的滴定法測燕麥總生物堿含量相比，最終的測定結(jié)果比較接近，但采用滴定法的文獻(xiàn)中沒有對結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗證。滴定法操作較繁瑣，終點確定往往難以準(zhǔn)確判斷，而且該法對含有一定色素的生物堿含量測定欠缺準(zhǔn)確性［20］。作者在前期考察滴定法測定燕麥總生物堿含量的試驗中，發(fā)現(xiàn)存在誤差較大，重復(fù)性不好(RSD＞10%)等問題(實驗數(shù)據(jù)未顯示)，很可能是受終點判斷的影響。黃建明等［21］曾采用容量法(硫酸回滴法)與酸性染料比色法測定草烏中總生物堿含量，得出二者均能準(zhǔn)確測定總生物堿含量，其中酸性染料比色法靈敏度較高，這與本研究的結(jié)果一致。

燕麥醇提物中除含有生物堿之外，還存在多酚、黃酮、皂苷等物質(zhì)，復(fù)雜的多組分體系可能會對生物堿的測定造成一定干擾。根據(jù)文獻(xiàn)報道［13，17］，燕麥生物堿的紫外吸收特征與曲尼司特(圖2)相似，在240和340 nm處有最大吸收峰。對于燕麥黃酮，其紫外最大吸收波長在270和420 nm附近［22］，與燕麥生物堿存在一定差異，而燕麥皂苷和多酚分別在560 nm［23］和 760 nm［24］有最大吸收，與燕麥生物堿差異較大。因此，在燕麥提取物中，采用本方法對燕麥生物堿的含量進(jìn)行測定時受其他物質(zhì)干擾的影響較小，對于經(jīng)過富集、除雜過程的生物堿測定可能會具有更好的適用性。但是，對于更復(fù)雜的體系組分，如含燕麥的混合原料中生物堿含量的測定，本方法的可行性則需要進(jìn)一步的驗證。燕麥總生物堿含量受燕麥品種、生長環(huán)境、栽培條件等因素的影響，不同研究者在燕麥中檢測到的總生物堿含量分布為25.21～347.55 mg/kg［25］。本研究中，測得燕麥中總生物堿含量均值為48.63 mg/kg，符合文獻(xiàn)報道的生物堿含量范圍，與Maliarova等［7］報道的含量較接近，結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確度。因此，酸性染料比色法是測定燕麥總生物堿含量的一種簡便、可信的檢測方法，可為燕麥總生物堿的分析檢測提供科學(xué)的依據(jù)和參考。