亞溶解型C5b- 9刺激GMC誘導(dǎo)KLF4與PCAF結(jié)合及結(jié)合部位的鑒定

虞天一，何風(fēng)霞，趙晨卉，余明皓，趙聃，劉玉，宮雅娟，夏露，邱文，張婧，王迎偉

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210003； 3.南京醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166；4.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210029)

人類系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是以腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell，GMC)病變?yōu)橹鞯哪I炎[1]，至今發(fā)病機(jī)制不明。大鼠Thy- 1腎炎(Thy- 1N)是研究MsPGN的模型,其病變有亞溶解型C5b- 9的依賴性[2- 3]。亞溶解型C5b- 9刺激GMC能上調(diào)一些轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔激活因子，調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3- 4]或促炎因子合成[5]，但其調(diào)控作用和機(jī)制尚未闡明。

Kruppel樣因子4(kruppel- like factor 4,KLF4)是一個(gè)Kruppel樣家族的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞的發(fā)育和炎癥有調(diào)控效應(yīng)[6]。P300/CBP相關(guān)因子(P300/CBP- assodated factor,PCAF)是具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄輔激活因子[7]，既能與轉(zhuǎn)錄因子作用，又可對(duì)蛋白進(jìn)行乙?；揎梉8]，參與調(diào)控細(xì)胞周期和炎癥。

本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，在Thy- 1N大鼠腎組織中或體外，用亞溶解型C5b- 9刺激大鼠GMC后KLF4和PCAF表達(dá)上調(diào)，且兩者的表達(dá)時(shí)相較接近。鑒于亞溶解型C5b- 9是Thy- 1N大鼠GMC病變的啟動(dòng)原，故本研究擬探討亞溶解型C5b- 9刺激GMC后KLF4與PCAF的結(jié)合情況及具體的結(jié)合部位，以期為今后解析MsPGN的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠GMC細(xì)胞系(HBZY- 1)由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。多克隆兔抗Thy- 1抗體(Thy- 1 Ab)由本室制備。補(bǔ)體來自20名正常人血清(NS)，補(bǔ)體熱滅活血清(heat- inactive serum，HIS)是指經(jīng)56 ℃ 30 min滅活后的NS。人C6缺陷血清(human C6 deficient serum, C6DS)購于美國Complement Technology公司。重組人C6來自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。

免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)細(xì)胞裂解液和兔IgG、羊IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。小鼠β- actin單克隆抗體(BM0627)由武漢博士德生物工程有限公司提供。羊KLF4多克隆抗體(sc- 1905)購于美國Santa Cruz公司。兔PCAF單克隆抗體(ab- 176316)購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 GMC的培養(yǎng)和亞溶解型C5b- 9的確定 將GMC細(xì)胞系加入完全MEM液中培養(yǎng)。用棋盤滴定法即以不同濃度的Thy- 1 Ab致敏GMC，然后加不同濃度正常人血清孵育。之后，用乳酸脫氫酶(LDH)法測定GMC溶解百分率，GMC溶解壞死率小于5%視為亞溶解劑量[3- 5]。本實(shí)驗(yàn)確定以5% Thy- 1 Ab與4% NS作為形成亞溶解型C5b- 9的最佳劑量。

1.2.2 亞溶解型C5b- 9刺激GMC時(shí)間點(diǎn)和分組處理 以亞溶解型C5b- 9分別刺激GMC 1、2、3、4、5、6、7和8 h；分成亞溶解型C5b- 9(5% Thy- 1 Ab+4% NS)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)+HIS(4% HIS)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)+C6DS(4% C6DS)、Thy- 1 Ab(5% Thy- 1 Ab)+C6DS(4% C6DS)+C6(2 mg·L-1)和MEM培養(yǎng)液6組[4]。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定與轉(zhuǎn)染 構(gòu)建pIRES2- KLF4和pIRES2- PCAF過表達(dá)質(zhì)粒以及pIRES2- HIS- KLF4和pIRES2- HIS- PCAF結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒，即(1)KLF4- S1(1～155 aa)、KLF4- S2(156～383 aa)、KLF4- S3(384～399 aa)和KLF4- S4(400～482 aa)；(2)PCAF- S1(1～386 aa)、PCAF- S2(387～443 aa)、PCAF- S3(444～567 aa)和PCAF- S4(568～674 aa)。將上述質(zhì)粒用NeonTM細(xì)胞電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)入GMC中[3- 5]。

1.2.4 IP和IB實(shí)驗(yàn) 不同處理的細(xì)胞加裂解液處理，具體的IP和IB實(shí)驗(yàn)方法與步驟參見文獻(xiàn)[3- 5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 亞溶解型C5b- 9刺激GMC后KLF4與PCAF結(jié)合情況

用亞溶解型C5b- 9刺激GMC不同時(shí)間，結(jié)果顯示，在刺激2 h時(shí)KLF4與PCAF的結(jié)合明顯升高，3 h時(shí)達(dá)到峰值，見圖1。表明亞溶解型C5b- 9刺激GMC后使KLF4與PCAF的表達(dá)升高并相互結(jié)合。

A.電泳條帶；B.半定量分析，與MEM培養(yǎng)液組比較，aP<0.05

圖1亞溶解型C5b-9刺激GMC不同時(shí)間KLF4與PCAF結(jié)合情況

2.2 不同處理組的GMC中KLF4與PCAF相互結(jié)合水平的比較

將GMC按前述6組處理，用KLF4抗體IP后用PCAF抗體進(jìn)行IB檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞溶解型C5b- 9組和Thy- 1Ab+C6DS+C6組與KLF4結(jié)合的PCAF水平高于其他組，見圖2。提示亞溶解型C5b- 9刺激GMC 3 h確能提高PCAF與KLF4結(jié)合的水平。

2.3 KLF4、PCAF過表達(dá)質(zhì)粒及KLF4、PCAF結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

IB檢測證實(shí)，轉(zhuǎn)染pIRES2- KLF4或pIRES2- PCAF的GMC中能表達(dá)KLF4或PCAF蛋白。將KLF4分成4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即KLF4- S1(1～155個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)、KLF4- S2(156～383個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域)、KLF4- S3(384～399個(gè)氨基酸的核定位信號(hào)

1為sublytic C5b- 9組，2為Thy- 1 Ab組，3為Thy- 1 Ab+HIS組，4為Thy- 1 Ab+C6DS組，5為Thy- 1 Ab+C6DS+C6組，6為MEM組，7為IgG對(duì)照組

A.電泳條帶;B.半定量分析,與MEM組比較，aP<0.01

圖2不同處理組GMC中KLF4與PCAF結(jié)合的比較

NLS)、KLF4- S4(400～482個(gè)氨基酸的鋅指DNA結(jié)合區(qū)域)，并在5′端插入HIS標(biāo)簽，構(gòu)建了pIRES2- HIS- KLF4的4個(gè)結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒。進(jìn)而將PCAF蛋白分成4個(gè)結(jié)構(gòu)域：分別為1～386個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄結(jié)合結(jié)構(gòu)域、387～443個(gè)氨基酸的乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性域、444～567個(gè)氨基酸的酵母轉(zhuǎn)錄輔激活子同源區(qū)、568～674個(gè)氨基酸的Bromo結(jié)構(gòu)域，并命名為PCAF- S1、PCAF- S2、PCAF- S3和PCAF- S4。在5′端插入HIS標(biāo)簽，構(gòu)建了pIRES2- HIS- PCAF的4個(gè)結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒。以上所有質(zhì)粒測序結(jié)果正確，表明構(gòu)建成功。

2.4 KLF4與PCAF結(jié)合部位的鑒定

將帶HIS的PCAF- S1、PCAF- S2、PCAF- S3和PCAF- S4分別與pIRES2- KLF4共轉(zhuǎn)染GMC 48 h，行IP和IB檢測發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染PCAF- S1和pIRES2- KLF4的KLF4表達(dá)量增高(圖3)。提示KLF4蛋白結(jié)合于PCAF的S1結(jié)構(gòu)域(即轉(zhuǎn)錄結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。

將帶HIS的KLF4- S1、KLF4- S2、KLF4- S3和KLF4- S4分別與pIRES2- PCAF共轉(zhuǎn)染GMC后48 h，行IP和IB檢測證實(shí)，KLF4- S1與pIRES2- PCAF轉(zhuǎn)染組的KLF4表達(dá)量升高(圖4)。提示PCAF結(jié)合在KLF4的S1結(jié)構(gòu)域(即轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)。

3 討 論

KLF4是一種能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已有研究表明，KLF4能通過結(jié)合HMGB1調(diào)控炎癥因子的表達(dá)[6]。PCAF屬于一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，其結(jié)構(gòu)含有轉(zhuǎn)錄結(jié)合結(jié)構(gòu)域或PCAF同源結(jié)構(gòu)域、乙?；D(zhuǎn)移酶活性域、酵母轉(zhuǎn)錄輔激活子同源區(qū)和布羅莫結(jié)構(gòu)域。已有研究[9]發(fā)現(xiàn)，PCAF可與KLFs家族成員相互作用，并能乙?；揎桲LF4，參與肺上皮的炎癥。

1為PCAF- S1+pIRES2- KLF4組，2為PCAF- S2+pIRES2- KLF4組，3為PCAF- S3+pIRES2- KLF4組，4為PCAF- S4+pIRES2- KLF4組

A.電泳條帶；B.半定量統(tǒng)計(jì)圖;與PCAF- S2+pIRES2- KLF4組、PCAF- S3+pIRES2- KLF4組、PCAF- S4+pIRES2- KLF4組比較，aP<0.01

圖3KLF4在PCAF上的結(jié)合部位鑒定

1為KLF4- S1+pIRES2- PCAF組，2為KLF4- S2+pIRES2- PCAF組，3為KLF4- S3+pIRES2- PCAF組，4為KLF4- S4+pIRES2- PCAF組

A.電泳條帶；B.半定量統(tǒng)計(jì)圖,與KLF4- S2+pIRES2- PCAF、KLF4- S3+pIRES2- PCAF組、KLF4- S4+pIRES2- PCAF組

圖4PCAF在KLF4上的結(jié)合部位鑒定

本實(shí)驗(yàn)前期研究證實(shí)，在Thy- 1N大鼠的腎組織和GMC用亞溶解型C5b- 9處理后，KLF4和PCAF的表達(dá)明顯上調(diào)，且時(shí)相基本一致。因此設(shè)想，亞溶解型C5b- 9刺激GMC或許可誘導(dǎo)KLF4和PCAF相互結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。

為了確證這一推測，本實(shí)驗(yàn)先用IP和IB鑒定了由亞溶解型C5b- 9刺激誘導(dǎo)的KLF4和PCAF的結(jié)合變化。結(jié)果顯示，在亞溶解型C5b- 9刺激GMC 2 h時(shí)KLF4和PCAF相互結(jié)合已明顯升高，3 h時(shí)達(dá)到峰值。進(jìn)一步分組實(shí)驗(yàn)表明，亞溶解型C5b- 9和Thy- 1 Ab+C6DS+C6組,KLF4和PCAF相互結(jié)合量也顯著上調(diào)。表明受亞溶解型C5b- 9刺激的GMC能誘導(dǎo)KLF4和PCAF結(jié)合增加。

本實(shí)驗(yàn)又構(gòu)建了帶HIS標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒，分別與KLF4或PCAF的過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GMC。用標(biāo)簽抗體行IP和IB檢測證實(shí)，KLF4結(jié)合于PCAF的轉(zhuǎn)錄結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而PCAF則結(jié)合在KLF4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。提示在大鼠Thy- 1N時(shí)，在GMC膜上的亞溶解型C5b- 9可刺激GMC，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子KLF4與轉(zhuǎn)錄輔激活因子PCAF相互結(jié)合形成復(fù)合物，而此復(fù)合物可能對(duì)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮一定的調(diào)控作用。