葉色退化的紫葉狼尾草生理變化特征

朱 婷, 章陸楊, 許志敏, 郝 亮, 陳 琳, 劉燕珍, 丁國昌

(福建農林大學園藝學院，福建 福州 350000)

顏色對觀賞價值的影響較為明顯[1].彩葉植物的葉色表現(xiàn)是遺傳因素和外部環(huán)境共同作用的結果，色素種類、比例和分布是導致葉色變化的直接原因[2].影響葉片呈色的外部因素主要包括光照、溫度、水分等，其中光照強度是影響彩葉植物葉色變化最重要的環(huán)境條件[3]，葉色退化也是彩葉植物的生命現(xiàn)象之一，對植物葉色影響較大.

觀賞草是一類株形優(yōu)美、色彩豐富的草本植物[4].彩葉觀賞草不僅繼承了觀賞草的優(yōu)良抗性及獨特的形態(tài)，并且在觀賞色彩上有了進一步提升，此類深紅、深紫色葉是最引人注目的色調之一，能夠營造出令人難忘的效果[5].紫葉狼尾草(Pennisetumsetaceum‘Rubrum’)是典型的深紫色彩葉觀賞草，它是禾本科狼尾草的栽培品種[6].其形態(tài)飄逸，整株紫紅色，穗狀花序輕柔，能保持至晚秋或初冬，極具觀賞性，成為人們青睞的園林植物之一.但在實際應用中發(fā)現(xiàn)，紫葉狼尾草遮陰狀態(tài)葉色變綠，且有葉色退化為綠色的現(xiàn)象，影響景觀效果.因此，本研究以自然光照、長期遮陰和葉色退化的紫葉狼尾草為對象，測定其葉色參數(shù)、色素含量、關鍵酶等指標，作以對比分析，從生理學角度探討紫葉狼尾草葉色退化生理機制，為后期研究紫葉狼尾草葉色形成及退化機理提供科學依據(jù)，并且為其葉色的分子水平研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在福建省福州市福建農林大學中華園試驗基地(26°5′6″N，119°13′52″)，位于福建省東部沿海閩江下游.資源豐富，溫暖濕潤，四季常青，雨量充沛，夏長冬短，霜少無雪，無霜期達326 d[7].

1.2 試驗材料

2018年3月春季，從福州樂彩園藝有限公司引進正常和有葉色退化表現(xiàn)的紫葉狼尾草幼苗.將正常生長的紫葉狼尾草幼苗，一部分進行露天盆栽，作為試驗對照組；一部分置于遮光率為30%的大棚內盆栽，作為試驗遮陰組，葉色退化的幼苗與對照的紫葉狼尾草同樣露天盆栽，管理水平一致.7月初，幼苗成株，且葉色退化的紫葉狼尾草完全變綠(圖1)，于7月4日早9: 00取樣本，選取生長健壯、長勢一致的植株，葉片均取自植株由上而下的第3～4片葉，用冰盒帶回實驗室，貯存于-80 ℃?zhèn)溆?，隨后進行色差及生理指標的測定.共測定18株，每組6株，6次生物學重復.

CK：對照組;TD：葉色退化;TS：長期遮陰.圖1 3組紫葉狼尾草葉色Fig.1 Leaf color of 3 groups of P.setaceum ‘Rubrum’

1.3 測定項目與方法

葉色參數(shù)測定參照丁廷發(fā)[8]的方法但略有改動.采用國產威福WS70型全自動色差計測定葉片顏色，測色光斑直徑為8 mm.選取葉色長勢相近的3片功能葉進行測定，每個葉片選取上、中、下3個部位，重復3次，記錄葉色參數(shù)L，a，b值，其中，L表示光澤明亮度，L值越大，亮度越高；a值表示紅/綠，a值越大，紅色越深，a值越小，綠色越深；b值表示黃/藍，b值越大，黃色越深，b值越小，藍色越深.葉片顏色指數(shù)(color index)計算[9]和等級劃分[10]參照Carreno et al對葡萄果實顏色的研究方法，等級劃分為：綠黃(CIRG<2)、粉紅(26)，其中，CIRG代表紅色葡萄果實顏色指數(shù)(colour index for red grapes).

葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的測定參照張秀君等[11]的方法但略有改動，每樣品重復3次，計算參照李合生[12]的方法.花色素苷的測定參照Pirie et al[13]的方法，每樣品重復3次，計算參照Xu et al[14]的方法.類黃酮、苯丙氨酸解氨酶( PAL)的檢測均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒進行測定，重復3次.查爾酮異構酶(CHI)采用上海仁捷生物科技有限公司研制的試劑盒進行測定，重復3次.查爾酮異構酶(CHI)的提取參照王惠聰[15]的方法，測定參照Lister[16]的方法，重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)整理和繪圖.采用SPSS 22.0軟件進數(shù)據(jù)分析，其中運用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，用Bivariate Correlations進行相關性分析.

2 結果與分析

2.1 葉色參數(shù)

按照Carreno et al[9-10]的方法得出CK為紅色級別，TS與TD均為黃綠級別，與肉眼觀察結果一致.方差分析結果表明(表1)，3組紫葉狼尾草的L值差異顯著(P<0.05)，TD最大，CK最小，TD分別比CK、TS高33.2%、8.0%.TS、TD兩組的a值、b值和葉色參數(shù)均無顯著性差異.CK的顏色指數(shù)遠大于TD和TS，分別是TD的2.39倍，TS的2.80倍.可知，a值對葉色的影響最大，長期遮陰和葉色退化的紫葉狼尾草顏色接近.

表1 3組紫葉狼尾草葉色參數(shù)1)Table 1 Leaf color parameters of P.setaceum ‘Rubrum’

1)表中同列間不同字母表示差異顯著(P<0.05).

2.2 光合色素含量

葉綠素和類胡蘿卜素是高等植物進行光合作用的主要色素，其中，葉綠素使葉片呈現(xiàn)綠色，類胡蘿卜素使葉片呈現(xiàn)橙黃色[2].從圖2可知，3組紫葉狼尾草葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量之間均存在顯著差異(P<0.05)且變化一致.其中，總葉綠素含量TD比CK、TS分別高36.6%、16.8%，類胡蘿卜素含量TD比CK、TS分別高33.2%、22.2%.可見，對照組的光合色素含量最低，長期遮陰和退化的紫葉狼尾草光合色素差異顯著(P<0.05)且退化的葉綠素含量最高，兩組葉色表現(xiàn)均為綠色但光合色素差異顯著，可能是由于葉色退化的紫葉狼尾草處于自然光下，生長狀態(tài)良好，葉片更加結實飽滿，葉肉細胞中含有更多的葉綠體，而導致葉綠素含量更高的結果.

2.3 花色素苷和類黃酮含量及色素含量百分比

花色素苷是高等植物葉片中存在的一種重要的類黃酮色素，與葉綠素、類胡蘿卜素共同決定葉片的呈色[17].從圖3可知，TS和TD的花色素苷含量無顯著差異，與CK間差異顯著(P<0.05)，CK分別是TD、TS的2.14倍、2.32倍.3組類黃酮含量差異顯著(P<0.05)，CK最大，TS最小，CK分別是TD、TS的1.97倍、2.70倍.可見，對照組紫葉狼尾草的花色素苷和類黃酮含量都遠高于兩種葉色變綠的紫葉狼尾草，退化組的花色素苷含量大于長期遮陰且兩者無顯著差異，這與對葉色參數(shù)a值的方差分析結果一致.

CK：對照組;TD：葉色退化;TS：長期遮陰.圖中同指標間不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖2 3組紫葉狼尾草光合色素含量Fig.2 Leaf photosynthetic content of 3 groups of P.setaceum ‘Rubrum’

葉色變化的內部因素主要是由光合產物的變化引起植物體內各類色素及其比例的變化，致使葉片呈現(xiàn)不同色彩[18].花色素苷是紫紅色葉植物的主要呈色因子[19]，因此，花色素苷的占比對于葉片呈現(xiàn)紫紅色有較大影響.從圖4可知，CK、TD、TS的花色素苷含量分別占27.6%、10.3%、11.5%，CK的含量占比遠高于TD、TS.CK、TD、TS的總葉綠素含量分別占53.3%、67.2%、67.4%，類胡蘿卜素含量占比分別為19.1%、22.5%、21.1%.可見，對照紫葉狼尾草花色素苷占比大，所以葉片呈紫色，長期遮陰與葉色退化的紫葉狼尾草總葉綠素和類胡蘿卜素含量占比大，所以兩者呈黃綠色.

2.4 PAL和CHI活性

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是花色素苷合成的第1個關鍵酶[20]，而花色素苷是葉色呈現(xiàn)紅紫色的關鍵色素，因此，PAL活性間接決定植物的葉色.PAL也是類黃酮類、木質素等合成過程中起重要調節(jié)作用的酶，抵抗外界環(huán)境的干擾[21].由方差分析可知(圖5)，3組紫葉狼尾草的PAL活性均存在顯著性差異(P<0.05)，CK最大，TS最小，雖然長期遮陰與退化組的紫葉狼尾草葉色相近，但PAL活性存在顯著差異(P<0.05).花色素苷和葉色參數(shù)的方差分析結果也顯示CK最大而TS最小.可見，PAL活性與花色素苷存在緊密聯(lián)系，葉色越紅，PAL活性越高.

CK：對照組;TD：葉色退化;TS：長期遮陰.圖中同指標間不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖4 3組紫葉狼尾草的色素含量百分比Fig.4 Leaf pigment percentage of 3 groups of P.setaceum ‘Rubrum’

有研究表明，CHI酶作為花色素苷合成的關鍵酶，在黃酮類化合物的轉化中起重要作用[22]，所以，CHI活性與葉色也可能存在一定的聯(lián)系.從圖5可知，CHI活性與PAL活性變化趨勢一致，三組間存在顯著差異(P<0.05)。CK組最紅，其CHI活性最高，TS組最綠，其CHI活性最低。推斷出CHI活性可能在紫葉狼尾草類黃酮化合物轉化過程起著重要作用。退化組與遮陰組的葉色無顯著差異，但兩者的PAL和CHI活性差異顯著(P<0.05)且遮陰組較低，可能是因為光脅迫使植物生長受阻，而使遮陰組酶活性降低.

2.5 各指標間相關性分析

各生理指標間的相關性分析如表2.葉色參數(shù)與色素含量直接相關，L值和b值與葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈顯著或極顯著正相關，a值與花色素苷和類黃酮含量呈極顯著正相關，花色素苷和類黃酮含量與葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈顯著或極顯著負相關.PAL和CHI活性是花色素苷合成過程中的關鍵酶[21-22]，通過分析可得，PAL和CHI活性與L值、b值呈極顯著負相關，與a值、花色素苷、類黃酮含量呈極顯著正相關，可推斷出，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、花色素苷、類黃酮、PAL和CHI活性對紫葉狼尾草葉色有重要影響.

表2 3組紫葉狼尾草的葉色參數(shù)及各生理指標相關性系數(shù)1)Table 2 Leaf color parameters and physiological indexes of 3 groups of P.setaceum ‘Rubrum’

1)*和**分別表示相關系數(shù)達到0.05和0.01的顯著水平.

3 結論與討論

通過葉色參數(shù)的測定使葉色量化，可更加精確地分析葉色與各生理指標之間的關系[23].該方法用于植物葉色研究的國內文獻較少，葛雨萱等[24]在研究黃櫨葉色及朱景樂等[25]在研究杜仲葉色時有涉及.葉色參數(shù)計算結果表明，對照組的顏色指數(shù)遠大于長期遮陰及退化的紫葉狼尾草，遮陰及退化的紫葉狼尾草葉色表現(xiàn)相近，均為黃綠色.

高等植物葉片中的色素主要是葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和花色素苷[26].對光合色素含量的測定表明，退化組的紫葉狼尾草葉綠素含量最高，并分析得出，可能是由于遮陰使植物受到光脅迫，葉片生長狀態(tài)不佳，葉肉細胞中的葉綠體數(shù)量減少，使得遮陰組較退化組葉綠素含量低.通過相關性分析得出，光合色素與葉色參數(shù)a值呈極顯著負相關(P<0.01).這與朱倩玉等[27]對4種彩葉灌木的研究結果一致.

花色素苷是植物呈現(xiàn)紫色的重要色素[19]，類黃酮可促進花色素苷的合成.本研究結果表明，花色素苷和類黃酮含量與葉色參數(shù)a值均呈極顯著正相關(P<0.01)，對照組花色素苷含量最高且與其他兩組差異顯著(P<0.05)，這與聶慶娟等[20]對紅櫨的研究結果一致.長期遮陰與葉色退化的花色素苷含量無顯著差異，與葉色參數(shù)a值的結果相互驗證.通過葉片色素含量百分比得出，對照組花色素苷占比遠大于其他兩組紫葉狼尾草，且這兩組的色素含量百分比接近，這也是對照呈現(xiàn)紫色而遮陰與退化組呈現(xiàn)綠色的主要原因，植物體內色素含量的比例決定葉片的呈色[18].通過植物葉片各色含量素與顏色指數(shù)的分析表明，對于紫葉狼尾草葉片呈色起決定性作用的為花色素苷.

PAL活性間接決定著植物葉色的形成，它的作用是催化苯丙氨酸形成肉桂酸[28].但也有學者指出，PAL與植物花色素苷的生物合成無關，更不是限制花色素苷生成的關鍵酶[15]。本研究結果表明，PAL活性與葉色參數(shù)a值、花色素苷含量、類黃酮含量呈極顯著正相關，與吳馭帆等對鵝耳櫪[29]的研究結果一致，說明PAL是紫葉狼尾草葉色形成的關鍵酶。對照組的PAL活性顯著高于其他兩組的活性(P<0.05)，雖然遮陰和退化的紫葉狼尾草花色素苷含量相近，但退化的PAL活性顯著高于遮陰的活性(P<0.05).

CHI是植物花色素苷合成過程中的重要酶，在類黃酮類化合物轉化過程中起著關鍵作用[22]，也有報道指出CHI活性與花色素苷的積累在不同植物中的相關性不一致[15]，該研究表明CHI活性與葉片參數(shù)a值、花色素苷含量及類黃酮含量均顯著正相關，說明CHI促進了紫葉狼尾草類黃酮的轉化，進而合成花色素苷，這與王慶菊等[30]對紫葉稠李葉片的研究結果類似。葉色退化的PAL和CHI活性均顯著高于長期遮陰的活性，這可能是由于紫葉狼尾草受到光脅迫后，生長較弱而導致的酶活性降低。

綜上可得，雖然葉色退化和長期遮陰的紫葉狼尾草在顏色上無差異，但根據(jù)兩者葉綠素含量和酶活性的規(guī)律分析得出，可能由于生長環(huán)境而導致的生理指標存在差異，且光合色素、花色素苷、類黃酮和PAL和CHI活性是影響紫葉狼尾草葉色的主要生理指標。其呈色機理在分子水平上的研究有待進一步深入.