巨菌草根內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola的分離、鑒定及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

林標聲, 汪麗芳, 宋昭昭, 賈雨雷, 林占熺

(1.龍巖學院生命科學學院,福建 龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院,福建 福州 350002；3.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

植物內(nèi)生固氮菌(Endophyticdiazotroph)是指那些定殖在健康植物體內(nèi),與宿主植物進行聯(lián)合固氮的一類微生物.根據(jù)菌體是否能夠定殖于植物組織內(nèi)部，固氮菌可分為根際固氮菌和內(nèi)生固氮菌[1].目前已從許多禾本科植物，如甘蔗、水稻、玉米、高粱及牧草等分離得到內(nèi)生固氮菌，如固氮螺菌(Azospirillum)[2]、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)[3]、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)[4]、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella.peneumoniae)[5]等.20世紀80年代以來，內(nèi)生固氮菌由于在禾本科作物上具有較強的固氮活性，又能促進植物生長及防治植物病害，成為聯(lián)合固氮研究領(lǐng)域的熱點[6-7].至今未有關(guān)于巨菌草聯(lián)合固氮菌的研究報道.

巨菌草(Pennisetumsp.)為多年生禾本科牧草，隸屬于狼尾草屬，具有直立、叢生、適應(yīng)性強、耐多次刈割、產(chǎn)草量高等特點.巨菌草根系發(fā)達，主根明顯，肉質(zhì)粗壯，入土深，可達3～4 m；側(cè)根發(fā)達，橫向分布可達2.0～2.5 m，抗旱性極強[8].巨菌草目前在內(nèi)蒙古、青海、寧夏等土地貧瘠的沙漠、流動沙丘等地種植，種植后沙地有機質(zhì)、酶活性及微生物數(shù)量明顯增加.經(jīng)測定，在荒坡地種植巨菌草在一定程度上能提高土壤堿解氮、有效磷、速效鉀的含量，這很可能是巨菌草內(nèi)生固氮菌在起作用[9].本研究利用無氮培養(yǎng)基對巨菌草成熟期根部進行了內(nèi)生固氮菌的分離與篩選、鑒定，選定其中豐度最高、酶活性最強的菌株作為研究對象，對其進行形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列鑒定，并對其進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，以期為將來巨菌草內(nèi)生固氮菌的資源開發(fā)及其固氮菌肥研制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

在福建農(nóng)林大學旗山校區(qū)菌草研究所試驗基地采集巨菌草的根.材料采集后立即清洗干凈，裝入無菌封口塑料袋，帶回實驗室處理.

1.2 培養(yǎng)基

Ashby無氮培養(yǎng)基：10 g·L-1甘露醇、0.2 g·L-1磷酸二氫鉀 、0.2 g·L-1七水硫酸鎂、 0.2 g·L-1氯化鈉、0.1 g·L-1硫酸鈣和5.0 g·L-1碳酸鈣，pH 7.0～7.2.

Nfb無氮培養(yǎng)基：5 g·L-1蘋果酸、 4.5 g·L-1氫氧化鉀、 0.5 g·L-1磷酸氫二鉀、 0.2 g·L-1七水硫酸鎂、0.02 g·L-1氯化鈣、0.1 g·L-1氯化鈉、2 mL溴百里酚藍(0.5%溶解于0.2N KOH中)、 4 mL EDTA、1 mL維生素( 200 mg·L-1VBe，100 mg·L-1生物素)，以及2 mL微量元素(0.4 g硫酸銅 + 0.12 g硫酸鋅+31.4 g硼酸+1 g鉬酸鈉+1.5 g硫酸錳)，pH 6.8～7.0.

肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)基[10](KP培養(yǎng)基)：20 g·L-1蔗糖、 32 g·L-1Na2HPO4、0.5 g·L-1酵母粉、 0.68 g·L-1KH2PO4、36 mg·L-1檸檬酸鐵、 26 mg·L-1CaCl2·2H2O、 0.3 mg·L-1MnSO4和 7.6 mg·L-1Na2MoO4·2H2O，pH 7.0～7.2.

1.3 方法

1.3.1 材料消毒 挑選無病變、品相良好的巨菌草根5～10 g，先用流水沖洗1～2 h，再采用75%(體積分數(shù))乙醇、2%(體積分數(shù))次氯酸鈉、無菌水依次洗滌.75%(體積分數(shù))乙醇浸泡60 s，2%(體積分數(shù))次氯酸鈉處理15～20 min，進行表面滅菌，無菌水再沖洗4次.采用稀釋涂布法，將最后一次的無菌水洗滌液涂布于LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，以無菌在LB培養(yǎng)基上生長為消毒合格.

1.3.2 內(nèi)生固氮菌的分離、篩選 將表面消毒完全的材料放入滅菌后的研缽中，用無菌剪刀剪碎后再加入適量PBS緩沖液研磨，取其汁液0.1 mL涂布在Ashby固體培養(yǎng)基平板上，28～30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落生長情況；將長出的單菌接種于Nfb固體培養(yǎng)基中進行復(fù)篩；將能在Nfb培養(yǎng)基上生長且培養(yǎng)基顏色由藍色變成綠色的菌株挑出，再次接種于Ashby固體培養(yǎng)基上，反復(fù)3次；最后將所篩選出的菌落接種于Ashby斜面培養(yǎng)基上，保存待用.觀察所分離菌株的菌落形態(tài)，進行固氮酶活性測定，選定分離比例較高且固氮酶活性高的菌株作為高效固氮菌的目的菌株，重復(fù)3次.

固氮酶活性測定：采用細菌固氮酶ELISA試劑盒和瑞士帝肯Tecan Sunrise F50酶標儀測定.試劑盒購自上海羽朵生物科技有限公司.

1.3.3 所篩選菌株的顯微形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列分析 對所分離的高效固氮菌株進行光學顯微鏡下的形態(tài)觀察，并進行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析[11].生理生化鑒定參照文獻[12].

16S rDNA 序列分析：提取純化細菌總DNA，設(shè)計PCR引物.F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′.R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反應(yīng)總體系25 μL，其中PCR TaqMix(2×Tag)12.5 μL，模板DNA 1 μL，PrimerF(10 μmoL·L-1) 0.2 μL，PrimerR(10 μmoL·L-1)0.2 μL，H2O 8.6 μL.PCR程序為：94 ℃5 min，94 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸5 min.瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段，經(jīng)凝膠回收純化后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序.測序所得的16S rDNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對，下載相近菌株的序列信息，按照軟件 Mega6 重新構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析菌株的分類學地位.

1.3.4 所篩選菌株的生長曲線和代時 所篩選的高效固氮菌經(jīng)Ashby無氮培養(yǎng)基固體平板活化后，分別接入液體Ashby無氮培養(yǎng)基和KP有氮培養(yǎng)基中，28～30 ℃下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每4 h取樣，測定其菌體生長量D600 nm，繪制生長曲線.分別在對數(shù)生長期初始和末期各取菌液1 mL，梯度稀釋后接入固體平板中培養(yǎng)，活菌計數(shù)，計算菌株在不同培養(yǎng)基條件下的代時(G).G=0.30(t2-t1)/(lgx2-lgx1)，其中t1、t2為對數(shù)生長初始和末期的時間(h)；x1、x2為對數(shù)生長初始和末期取樣時的活菌總數(shù).試驗重復(fù)3次.

1.3.5 所篩選菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化 將所篩選的高效固氮菌經(jīng)液體Ashby無氮培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期后，按設(shè)定的接種量接入250 mL KP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng).根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選定8個因素進行Plackett-Burman試驗設(shè)計(表1)，以菌體生長量D600 nm為響應(yīng)值篩選出影響培養(yǎng)效果的顯著因素做進一步的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定適合菌株培養(yǎng)的最優(yōu)工藝條件，并進行最佳工藝條件下的驗證性試驗.試驗重復(fù)3次，取均值.

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計Table 1 Plackett-Burman experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 巨菌草根部內(nèi)生固氮菌的分離、篩選及鑒定

巨菌草根部內(nèi)生固氮菌經(jīng)Ashby無氮培養(yǎng)的分離，篩選，得到了112個菌落，其中5種類型菌落酶活性較高，且菌落形態(tài)符合固氮菌基本特性.菌株GN02在各菌落中所占比例最高，固氮酶活性較高，因此初步選定其作為高效固氮菌(表2).

表2 篩選菌株的菌落形態(tài)和固氮酶活性1)Table 2 Colonial morphology and nitrogenase activity of the screened strains

1)同一列數(shù)字后相同字母表示差異不顯著(P<0.05)，不同字母表示差異顯著(P>0.05).

圖1 固氮菌GN02的16s rDNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of diazotrophs GDN2 16s rDNA

顯微鏡下，GN02菌株革蘭式陰性，較粗，短桿狀，大小(0.5～0.8)μm×(1～2)μm，單獨、成雙或短鏈狀排列；無芽孢，有菌毛和莢膜，莢膜較厚，但無鞭毛，不運動.生理生化鑒定結(jié)果表明：該菌株能利用葡萄糖、乳糖和枸櫞酸；經(jīng)硝酸鹽還原試驗、VP試驗、丙二酸鹽試驗、檸檬酸鹽試驗和脲酶試驗呈陽性，經(jīng)氧化酶試驗、吲哚試驗和甲基紅試驗呈陰性.

菌株GN02擴增出的16S rDNA片斷條帶單一(圖1)，經(jīng)測序得到長度約1.6 kb的序列.將此序列與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進行同源性比較(圖2)，選取NCBI數(shù)據(jù)庫中同源性在95%以上的相關(guān)菌株構(gòu)建NJ進化樹，可知菌株GN02與克雷伯菌屬(Klebsiella)的幾個菌株的親源關(guān)系最近，相似性均達99%以上.綜合菌株GN02的形態(tài)特征、生理生化特征以及l(fā)6S rDNA序列分析結(jié)果，將其初步鑒定為變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola).

圖2 固氮菌GN02的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of diazotrophs GN02

2.2 固氮菌GN02的生長性能

固氮菌GN02在Ashby無氮培養(yǎng)基和KP有氮培養(yǎng)基中的生長曲線如圖3所示.固氮菌GN02在Ashby無氮培養(yǎng)基中進入對數(shù)生長期的時間為20 h，經(jīng)平板活菌計數(shù)其G為0.8～1.2 h；而在KP有氮培養(yǎng)基中進入對數(shù)生長期的時間為8 h，G為2.5～2.8 h.整體上，固氮菌GN02在KP有氮培養(yǎng)基中菌體量的D600 nm略高，且其穩(wěn)定期更長.結(jié)果表明，固氮菌GN02在有氮源提供的情況下，生長速度更快，菌體量更多，且能夠保持更長時間.

圖3 菌株GN02在Ashby無氮培養(yǎng)基和KP有氮培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 The growth curve of the strain GN02 in Ashby nitrogen-free medium and KP nitrogen medium

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化固氮菌GN02菌體的生長條件

2.3.1 影響固氮菌GN02菌體生長關(guān)鍵因素的篩選 采用Minitab 15軟件對表1的Plackett-Burman試驗設(shè)計進行分析，結(jié)果(表3、4)表明：影響固氮菌GN02菌體生長關(guān)鍵因素的重要性依次排序是：溫度(X3)>pH(X2)>蔗糖(X9)>培養(yǎng)時間(X5)>轉(zhuǎn)速(X6)>裝液量(X7)>接種量(X4)>酵母粉(X8).其中，溫度(X3)、pH(X2)和蔗糖(X7)對響應(yīng)值影響達到了顯著水平，因此選定此3個因素進行響應(yīng)面分析.

2.3.2 固氮菌GN02最優(yōu)培養(yǎng)條件的確定 以固氮菌GN02菌體生長D600 nm為響應(yīng)值進行Box-Benhnken設(shè)計，三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果如表5所示.利用Design-Expert 7.0軟件對響應(yīng)值進行回歸分析，得到的響應(yīng)值D600 nm和各因素變量之間的二元回歸方程為：R=+1.44+0.041×A+0.032×B+3.750×10-3×C+7.500×10-3×A×B-5.000×10-3×A×C+0.018×B×C-0.037×A2-0.034×B2-0.042×C2.

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 3 Design and response values of Plackett-Burman experiments

表4 8個因素的顯著性分析Table 4 Analysis of the significance of the eight factors

表5 三因素Box-Benhnken試驗設(shè)計安排與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Benhnken experiments on the three factors

該回歸模型的方差分析結(jié)果(表6)表明該模型具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，顯著).其中失擬項不顯著(P>0.05)，表明回歸方程誤差小，擬合情況好，能真實反映各因素與響應(yīng)值之間的相互關(guān)系.各因素方差分析結(jié)果表明，對響應(yīng)值D600 nm影響大小的依次順序為：溫度(A)>pH(B)>蔗糖(C)，其中溫度(A)和pH(B)對響應(yīng)值影響顯著(P<0.05).

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis and results of regression model

各因素響應(yīng)面曲面分析結(jié)果如圖4所示，根據(jù)所得的模型可預(yù)測，固氮菌GN02菌體生長的最佳工藝條件為：溫度37.1 ℃，pH 5.6，蔗糖25.6 g·L-1.在該條件下D600 nm能達到1.47.按上述的最優(yōu)工藝條件進行驗證性試驗，重復(fù)3次，D600 nm均值為1.48，與理論預(yù)測值(1.47)相近，重復(fù)性好，且比優(yōu)化前Plackett-Burman試驗設(shè)計的D600 nm值(1.21)提高了22.31%.

圖4 3個因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plots for the effects of cross-interactions among three factors

3 小結(jié)與討論

固氮菌由于自身的生長特性能在無氮培養(yǎng)基中生長，因此常利用無氮培養(yǎng)基來富集、分離固氮菌[13].本試驗選定Ashby和Nfb無氮培養(yǎng)基作為選擇性培養(yǎng)基，從巨菌草成熟期根部分離得到1株具有高效固氮性能的內(nèi)生固氮菌GN02，初步鑒定其為變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola).KP培養(yǎng)基是實驗室內(nèi)肺炎克雷伯氏菌常用的生長培養(yǎng)基[14]，因此選定KP培養(yǎng)基作為所分離菌株的生長培養(yǎng)基，研究其培養(yǎng)條件.結(jié)果表明，所分離的固氮菌株GN02在有氮源提供的KP培養(yǎng)基中，其生長速度、菌體量和穩(wěn)定期維持時間均明顯優(yōu)于無氮源提供的Ashby培養(yǎng)基.

目前，國內(nèi)關(guān)于禾本科植物內(nèi)生固氮菌的報道主要來自甘蔗、玉米和水稻[15-17]，還未有巨菌草的相關(guān)報道.本研究首次從巨菌草中分離得到了高豐度、高固氮性能的內(nèi)生固氮菌變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，與來自其他禾本科植物的克雷伯氏菌屬菌株具有較好的同源性，表明克雷伯氏菌屬可能是禾本科植物的重要內(nèi)生固氮菌，在禾本科植物的聯(lián)合固氮中能起到重要的作用[18].