皮革腎島衣一個(gè)聚酮合酶基因的克隆與鑒定

原曉龍, 華 梅, 陳 劍, 張傳光, 王 毅

(云南省林業(yè)科學(xué)院/云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201)

聚酮化合物(polyketides)廣泛存在于細(xì)菌、真菌和植物中，是一類由聚酮合酶(polyketides synthases，PKS)催化簡(jiǎn)單單體分子(乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A)間通過連續(xù)的縮合和延伸形成的一類次生代謝產(chǎn)物，其種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛[1].聚酮化合物包括大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、蒽醌類和聚醚類等[2]，具抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制劑等生物活性[3]，在臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有廣泛的應(yīng)用[3-5].聚酮合酶在真菌次生代謝過程中具有重要作用，能夠催化合成許多具活性的聚酮類化合物[6-7].隨著二代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，人們已經(jīng)獲得了大量的真菌基因組和聚酮合酶基因數(shù)據(jù)[8]，僅通過基因敲除[9]和異源表達(dá)[10]確定了部分基因的功能，而對(duì)其合成機(jī)理目前尚不清楚[8].

真菌PKS是一個(gè)巨型多功能蛋白，依據(jù)其結(jié)構(gòu)和催化方式可將其歸入Ⅰ型PKS[11].其結(jié)構(gòu)域包括：ACP?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(SAT)、?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(AT)、?；D(zhuǎn)移蛋白結(jié)構(gòu)域(ACP)、酮酯?；厦附Y(jié)構(gòu)域(KS)、酮酯酰基還原酶結(jié)構(gòu)域(KR)、烯?；€原酶結(jié)構(gòu)域(ER)、脫水酶結(jié)構(gòu)域(DH)、甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(MT)和硫酯酶釋放結(jié)構(gòu)域(TE)、這些結(jié)構(gòu)域可在次生代謝產(chǎn)物合成的循環(huán)過程中重復(fù)使用[2,12].依據(jù)聚酮中間體的β-側(cè)鏈酮基的還原程度，可將真菌Ⅰ型PKS分為非還原(non-reducing, NR)、部分還原(partially reducing, PR)和高度還原(highly reducing, HR)聚酮合酶[8,13]，其中PT和SAT結(jié)構(gòu)域是真菌NR-PKS所獨(dú)有的，而缺少ER、KR和DH結(jié)構(gòu)域[13].真菌NR-PKS能夠催化合成芳香聚酮和大環(huán)內(nèi)酯聚酮，芳香聚酮包括黑色素[14]、苔色酸[9]等；而大環(huán)內(nèi)酯聚酮多為14～16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，如紅霉素及其衍生物等[15].真菌Ⅰ型PKS中AT控制延伸單元但不能控制聚酮鏈的長(zhǎng)度，其長(zhǎng)度可能由KS控制[16].

本研究以地衣型真菌(lichen forming fungus, LFF)皮革腎島衣(Nephrmopsispallescens)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行挖掘分析，通過RT-PCR首次克隆得到1條Ⅰ型PKS基因的全長(zhǎng)cDNA序列(NpPKS2)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，比較NpPKS2在不同培養(yǎng)基上具體表達(dá)情況，以期為L(zhǎng)FFN.pallescens中的聚酮合酶基因的挖掘以及研究異源表達(dá)LFFN.pallescens中的聚酮產(chǎn)物提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LFFN.pallescens由韓國(guó)地衣資源中心贈(zèng)送，將其接種到MY培養(yǎng)基并置于15 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)繁.

1.2 方法

1.2.1NpPKS2基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 以LFFN.pallescens的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，挖掘出1條Ⅰ型PKS基因序列.以這條PKS基因序列為模板利用Primer 5.0設(shè)計(jì)得到擴(kuò)增引物NpPKS2F(5′-ATGGCGGATTTGCAGATG-3′)、NpPKS2F(5′-TTTAATCATTTCAACGCC-3′).收獲LFF皮革腎島衣菌絲團(tuán)0.5 g，采用RT-PCR以NpPKS2F、NpPKS2F為引物，利用高保真DNA聚合酶(TaKaRaTM)克隆該基因，回收純化后將目的片段與pUC18克隆載體連接，然后置于含有Amp+的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，將含有目的片段的陽性克隆測(cè)序，并將該基因命名為NpPKS2.

1.2.2 NpPKS2基因及其蛋白氨基酸的生物信息學(xué)分析 利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的在線程序ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)開放閱讀框，用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序?qū)ζ涞鞍仔蛄屑昂怂嵝蛄羞M(jìn)行同源性比較和分析，用CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)數(shù)據(jù)庫搜索該蛋白的結(jié)構(gòu)域，用ProtParam (http: / /web. expasy.org /protparam/)預(yù)測(cè)NpPKS2蛋白的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，用Target P預(yù)測(cè)該蛋白作用的細(xì)胞位置，并用SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析該蛋白是否含有信號(hào)肽.選擇真菌中與NpPKS1蛋白序列同源性較高，且已經(jīng)過功能鑒定的基因的蛋白序列共16條，通過MEGA 6.0多序列比對(duì)后，采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)、自檢重復(fù)1 000次，其余采用系統(tǒng)默認(rèn)值構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3NpPKS2基因在不同培養(yǎng)基上的熒光定量表達(dá)分析 將從MY培養(yǎng)基上收獲的LFF皮革腎島衣菌絲團(tuán)重新接種LMG、BMG、SMGY、YMG、TMG、MY、PMG等培養(yǎng)基(表1)上，15 ℃恒溫條件下培養(yǎng)30 d后，分別從各培養(yǎng)基上收獲0.5 g該型真菌的菌絲團(tuán)，3次重復(fù)取樣.

表1 試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基Table 1 The medium used in the study

收獲篩選培養(yǎng)基上的樣品后，提取真菌總RNA，選擇質(zhì)量較好、濃度合適的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.然后以其cDNA為模板，以TPKS2F(5′-TACTTGACTAGTGTATTAAAGG-3′)和TPKS2R(5′-ATCTCTTTTGTTGAGATG-3′)作為檢測(cè)引物，用qPCR技術(shù)檢測(cè)LFFN.pallescens中NpPKS2基因在不同培養(yǎng)基上的具體表達(dá)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 NpPKS2基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)該DNA片段長(zhǎng)約6.5 kb；測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該片段長(zhǎng)6 249 bp.將該DNA片段通過NCBI上的BLASTN進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，僅有1條DNA序列與其相似，為玉米炭疽病菌(Colletotrichumgraminicola, XM_008102519.1)的Ⅰ型PKS基因，其一致性為73%，推測(cè)該基因是一種新型的真菌聚酮合酶基因.

2.2 NpPKS2基因及其蛋白氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

獲得NpPKS2基因的全長(zhǎng)cDNA后，采用常規(guī)的生物信息學(xué)分析方法對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：該基因的開放閱讀框可編碼2 082個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為226.87 ku，理論等電點(diǎn)為5.64，蛋白質(zhì)分子中含有酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)量為236個(gè)，堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)量為189個(gè)，結(jié)構(gòu)式為C10035H15780N2672O3061S87，脂肪族氨基酸指數(shù)為84.70，總平均親水性為-0.152，不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為44.90，屬于不穩(wěn)定蛋白；不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽；該蛋白在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)揮功能；該蛋白含有6個(gè)呈線型排列的結(jié)構(gòu)域，其排列順序?yàn)镾AT-KS-AT-PT-ACP-TE，各個(gè)結(jié)構(gòu)域的活性保守位點(diǎn)分別為(圖1)：SAT(ACP?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域)(T(I/V)IGPPSVL)、KS(β-酮基合成酶結(jié)構(gòu)域)(IA(I/F)VGM-(E/Q)FWD)、AT(乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域)(GHSE(A/G)AAG)、PT(產(chǎn)物模板結(jié)構(gòu)域)(SPYWGE)、ACP(?；d體蛋白結(jié)構(gòu)域)(A(E/D)LGVDSIM(A/S)IE)、TE(硫酯酶釋放結(jié)構(gòu)域)(GGFS(A/G)G)；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示：該系統(tǒng)進(jìn)化樹分為4個(gè)獨(dú)立分支，其中NpPKS2與馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei, EEA25563)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans, AN7909)、灰霉病菌(Botryotiniafuckeliana, XP_001559596)、赤霉病菌(Gibberellazeae, ABB90282)聚為一支，該分支編碼的酶蛋白催化合成非還原型單環(huán)芳香族聚酮苔色酸(orsellinic acid)，與其他非還原型聚酮化合物形成不同的分支.據(jù)此可推測(cè)NpPKS2基因編碼非還原型聚酮合酶，其催化產(chǎn)物可能為苔色酸.

2.3 NpPKS2基因在不同培養(yǎng)基上的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

以TPKS2F和TPKS2R作為檢測(cè)引物、以各篩選培養(yǎng)基上獲得樣品的cDNA為模板的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NpPKS2基因的檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)：NpPKS2基因在同樣的溫度條件下，在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)量差異極其顯著，其表達(dá)量從高到低依次為BMG(43.7)、TMG(11.4)、SMGY(10.2)、YMG(4.5)、MY(3.3)、BD(1.4)、LMG(1.0).

3 討論

通過生物信息學(xué)分析方法能夠?qū)Ψ蛛x得到的基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析.本試驗(yàn)克隆得到LFF皮革腎島衣中1個(gè)NR-PKS基因NpPKS2，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域?yàn)镾AT-KS-MAT-PT-ACP-TE，是組成NR-PKS的典型結(jié)構(gòu)域；NR-PKS通常含有1個(gè)SAT結(jié)構(gòu)域作為簡(jiǎn)單分子的起始選擇單元[9]， PT結(jié)構(gòu)域也可作為識(shí)別NR-PKS的特征結(jié)構(gòu)域[17].分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分成了4個(gè)獨(dú)立分支，其中CladeⅠ含有在煙曲霉(A.fumigatus)中編碼分生孢子色素的albA基因(AAC39471)，通過基因敲除試驗(yàn)證實(shí)albA基因的產(chǎn)物為藍(lán)綠色的分生孢子色素[18]，構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)中的wA基因(CAA46695)，經(jīng)過wA基因的突變體驗(yàn)證該基因的產(chǎn)物為分生孢子色素[19]，可推測(cè)CladeⅠ分支的目的產(chǎn)物為分生孢子色素.在CladeⅡ中，絲狀真菌Glarea lozoyensis敲除pks1基因(AAN59953)的突變體表型為白化體，證實(shí)pks1基因的產(chǎn)物為黑色素[20]，推斷該分支的目的產(chǎn)物為黑色素.Clade Ⅲ的構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)通過缺失AN7909基因的突變體和野生型比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因的目的產(chǎn)物為苔色酸[9,21-22]，用同樣的方法發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)pks14基因(ABB90282)參與苔色酸合成[23-24]，據(jù)此可推斷該分支催化產(chǎn)物為苔色酸.Clade Ⅳ分支，在紅曲霉(Monascuspurprueus)中比較含pksCT基因(BAD44749)的野生型菌株與缺失pksCT基因的菌株確定了該基因參與橘霉素的合成，是一種由苔色酸為前體合成的大環(huán)內(nèi)酯類[25].綜上所述，地衣型真菌皮革腎島衣NpPKS2聚在Clade Ⅲ中，可推斷NpPKS2很可能參與革腎島衣中苔色酸的生物合成.

Np:皮革腎島衣(Nephromopsis pallescens);Gl:Glarea lozoyensis;Fm:Fonsecaea multimorphosa;Pr:產(chǎn)紅青霉菌(Penicillium rubens);Pc:厚垣普可尼亞菌(Pochonia chlamydosporia).圖1 NpPKS2蛋白各結(jié)構(gòu)域活性保守位點(diǎn)Fig.1 The active conserved amino acids sites of NpPKS2 in each domain

圖2 NpPKS2與其他真菌NR-PKS蛋白序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of NpPKS2 and other fungal NR-PKS

圖3 NpPKS2基因在不同培養(yǎng)基上的具體表達(dá)情況Fig.3 Expressions of NpPKS2 gene in different medium

在其它培養(yǎng)條件一致的情況下，采用熒光定量PCR檢測(cè)NpPKS2基因在不同培養(yǎng)基上的具體表達(dá)量，結(jié)果表明BMG培養(yǎng)基能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，且與其它培養(yǎng)基上的表達(dá)量差異巨大，這些現(xiàn)象也表明存在其他真菌的OAS基因簇中，如在構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)中編碼苔色酸的orsA基因同樣受到生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)基的影響[9].這可能與大多數(shù)聚酮化合物的生物合成基因簇在實(shí)驗(yàn)室條件下是沉默的有關(guān)[22]，為了改變這一現(xiàn)象通?？赏ㄟ^在異源宿主中過量表達(dá)[26]、在生物合成途徑中進(jìn)行異位表達(dá)[27]、表觀遺傳[10]或通過“一菌多產(chǎn)物(one strain many compounds, OSMC)”[28]來獲得目的聚酮產(chǎn)物.本文從LFF皮革腎島衣中克隆得到NpPKS2基因，推測(cè)其功能并比較該基因在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)，為下一步該基因功能確定以及通過異源表達(dá)大量獲得苔色酸提供前期基礎(chǔ)，同時(shí)為其他地衣聚酮產(chǎn)物的表達(dá)和鑒定提供借鑒.