• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    百合熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LlHsfC1的鑒定、表達(dá)與亞細(xì)胞定位

    2019-01-25 05:46:22隋娟娟何俊娜于守超義鳴放
    關(guān)鍵詞:耐熱性擬南芥百合

    曹 興, 易 瑾, 隋娟娟, 吳 澤, 何俊娜, 于守超, 趙 燕, 義鳴放

    (1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東 聊城 252059;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽 阜陽(yáng) 236037;4.北京師范大學(xué)附屬中學(xué)平谷第一分校,北京 101204)

    百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉,具有重要的觀賞、食藥用價(jià)值.百合屬的大多數(shù)種及品種性喜冷涼、濕潤(rùn)氣候,耐熱性較差.目前,國(guó)內(nèi)主栽的百合品種生育的適溫為16~24 ℃,30 ℃以上時(shí),生育受到嚴(yán)重抑制[1].然而我國(guó)大部分地區(qū)夏季炎熱,高溫造成百合生長(zhǎng)停滯、植株矮小、少花盲花、莖桿軟、病蟲害嚴(yán)重等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響切花的產(chǎn)量和質(zhì)量,并造成種球退化,制約著我國(guó)百合商品化周年生產(chǎn)[2].所以,提高百合耐熱性是解決這一問題的關(guān)鍵.

    高溫脅迫下,植物體內(nèi)迅速合成熱激蛋白(heat shock protein, Hsp),Hsp的大量積累,可作為分子伴侶協(xié)助其他相關(guān)蛋白的重新折疊、穩(wěn)定、運(yùn)輸和降解,維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)高溫的耐受力,從而提高植物的耐熱性.熱激蛋白的表達(dá)受熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)的調(diào)控.熱脅迫下,Hsf特異結(jié)合在Hsp基因的熱激元件(heat shock element, HSE)上,并募集其他轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,導(dǎo)致Hsp基因的轉(zhuǎn)錄和Hsp的積累[3].根據(jù)寡聚域(oligomerization domian, OD)結(jié)構(gòu)的不同,Hsf可分為HsfA、HsfB 和HsfC三類,A類Hsf含有激活模序(aromatic, large hydrophobic and acidic amino residues, AHA)具有轉(zhuǎn)錄激活活性,而B類和C類則缺少AHA[4].目前,研究較多、功能較為明確的是A類Hsf[5-7],C類Hsf的研究較少.在前期研究中,從百合中分離得到了5個(gè)A類Hsf基因LlHsfA1[8]、LlHsfA2a[9]、LlHsfA2b[10]、LlHsfA3a和LlHsfA3b[11],研究表明它們參與了百合的熱激反應(yīng)(heat shock response, HSR).

    在百合野生種中,麝香百合(LiliumlongiflorumThunb)的耐熱性較強(qiáng),它們的雜交品種也具有較強(qiáng)的耐熱性.本研究從麝香百合雜種系‘白天堂’中鑒定了C類熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LlHsfC1,研究它與百合耐熱性的關(guān)系,進(jìn)一步豐富百合Hsf參與的熱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò).通過解析耐熱百合品種的高溫逆境響應(yīng)機(jī)制,鑒定調(diào)控耐熱性的關(guān)鍵基因,對(duì)于采用分子育種手段來提高現(xiàn)有主栽百合品種的耐熱性具有重要的理論和實(shí)踐意義.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)材料為麝香百合(Liliumlongiflorum)品種‘白天堂’(‘White Heaven’)組培苗,保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.亞細(xì)胞定位使用的材料為紫皮洋蔥(Alliumcepa),購(gòu)買于超市.

    表1 PCR引物1)Table 1 Primers applied in PCR

    1)下劃線表示酶切位點(diǎn).

    試驗(yàn)所用的RNA提取試劑盒、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體、T4連接酶、SalⅠ、SpeⅠ、SmaⅠ等購(gòu)自TaKaRa公司;熒光定量試劑盒SYBR FAST qPCR Universal Kit購(gòu)自KAPA公司;卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)購(gòu)自Sigma公司;其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純;擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1);DNA測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成.

    1.2 百合HsfC1基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

    根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的百合LlHsf1(AEU17861)的氨基酸序列,進(jìn)行BLAST比對(duì),選擇相似度較高的同源蛋白,用DNAMAN 5軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析.用EXPASY (https://www.expasy.org/tools/)中的ProtParam、SMART、PSORT、NetPhos等在線工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析;用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

    1.3 LlHsfC1蛋白亞細(xì)胞定位分析

    利用DNAMAN 5分析LlHsfC1的ORF序列的酶切位點(diǎn),結(jié)合pCAMBIA1300-GFP載體,選用SalⅠ和SpeⅠ作為融合表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn),并設(shè)計(jì)上游特異引物SPF1和下游特異引物SPR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增.雙酶切pCAMBIA1300-GFP空載質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接,獲得pCAMBIA1300-LlHsfC1-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體,雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證連接是否成功.用基因槍轟擊法[12]將構(gòu)建好的重組瞬時(shí)表達(dá)載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24 h的洋蔥表皮細(xì)胞中,空載作為對(duì)照.暗培養(yǎng)24 h后在激光共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)下進(jìn)行觀察和拍照,并用EZ-C1軟件對(duì)照片進(jìn)行分析和處理.

    1.4 LlHsfC1基因表達(dá)分析

    選擇生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的‘白天堂’組培苗作為基因表達(dá)分析的材料.

    LlHsfC1在熱激處理下的表達(dá):用37和42 ℃熱激處理百合組培苗,分別在處理1、3、6、12 h取葉片,以22 ℃處理為對(duì)照.

    LlHsfC1在Ca2+處理下的表達(dá):分別在22和37 ℃下,分別用20 mmol·L-1CaCl2和10 mmmol·L-1EGTA溶液浸沒百合組培苗的根部,用去離子水處理作對(duì)照,處理1 h后取葉片.

    所取組織用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用提取RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)的方法檢測(cè)基因的表達(dá),步驟參照KAPA SYBR FAST qPCR Universal Kit熒光定量試劑盒說明書,儀器為Applied Biosystems Step One System 熒光定量PCR儀.LlHsfC1的擴(kuò)增引物為qF1和qR1,內(nèi)參基因18S rRNA的擴(kuò)增引物為18SqF和18SqR.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 3 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán).每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),采用2-ΔΔCT法[13]分析基因的相對(duì)表達(dá)量.

    1.5 植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LlHsfC1的構(gòu)建

    利用DNAMAN 5分析LlHsfC1的ORF序列的酶切位點(diǎn),結(jié)合pCAMBIA1301載體,選用SmaⅠ和SalⅠ作為融合表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn).以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)上游特異引物SPF2和下游特異引物SPR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后連接到pMD18-T載體.雙酶切pCAMBIA1301空載質(zhì)粒和pMD18-T-LlHsfC1質(zhì)粒,純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接,獲得pCAMBIA1301-LlHsfC1過表達(dá)載體,雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證連接是否成功.測(cè)序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)植物轉(zhuǎn)基因研究.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 百合LlHsfC1基因鑒定及生物信息學(xué)分析

    LlHsf1(GenBank登錄號(hào)JN792932)ORF區(qū)序列長(zhǎng)為780 bp,編碼259個(gè)氨基酸(圖1).BLAST的結(jié)果顯示,該基因與其他物種的HsfC1基因有較高的同源性,暫將其命名為L(zhǎng)lHsfC1.

    圖1 百合LlHsfC1基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame of LlHsfC1 and the predicted amino acid sequences

    ProtParam在線工具預(yù)測(cè)百合LlHsfC1蛋白包含259個(gè)氨基酸殘基,分子式為C1350H2107N381O385S9,分子質(zhì)量為30.1 ku.親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.536(<0),屬于親水性蛋白,不穩(wěn)定系數(shù)為64.28(>40),屬于不穩(wěn)定蛋白,理論等電點(diǎn)(PI)為9.61,屬于堿性蛋白.蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具NetPhos預(yù)測(cè)LlHsfC1含有22個(gè)絲氨酸(Ser)和6個(gè)蘇氨酸(Thr)潛在磷酸化位點(diǎn).蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位工具PSORT預(yù)測(cè)LlHsfC1定位于細(xì)胞核內(nèi).

    將LlHsfC1及與其相似度較高的其他植物的HsfC1氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì),利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具SMART進(jìn)行分析,結(jié)果表明LlHsfC1蛋白具有C類Hsf的典型結(jié)構(gòu)(圖2A):在靠近N端18~109個(gè)氨基酸殘基形成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, DBD);第124~167個(gè)氨基酸殘基形成OD,該寡聚域主要由兩段疏水性氨基酸殘基(hydrophobic amino acid residues A/B, HR-A/B)組成;第178~191個(gè)氨基酸殘基形成核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS).與百合A類熱激轉(zhuǎn)錄因子LlHsfA1、LlHsfA2a相比,LlHsfC1缺少AHA模序和核輸出信號(hào)(nuclear export signal, NES)(圖2B).

    LlHsfC1:Lilium longiflorum百合AEU17861;AcHsfC1:Ananas comosus鳳梨XP_020098172;AtHsfC1:Arabidopsis thaliana擬南芥At3g24520;EgHsfC1:Elaeis guineensis油棕XP_010911318;MaHsfC1:Musa acuminata小果野蕉XP_009415170;PdHsfC1:Phoenix dactylifera海棗XP_008810034.A.百合LlHsfC1與其他植物HsfC1氨基酸序列同源比對(duì);B.百合LlHsfC1與LlHsfA1、LlHsfA2a基本結(jié)構(gòu)比較.圖2 百合LlHsfC1的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Basic structure of LlHsfC1

    將百合LlHsfC1及與其同源性較高的其他植物的HsfC1、擬南芥21個(gè)Hsf的氨基酸序列,用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示Hsf家族可分為A、B、C三類,百合LlHsfC1歸屬C類.LlHsfC1與同為單子葉植物的海棗(Phoenixdactylifera)HsfC1的親緣關(guān)系最近(圖3),相似度達(dá)60%.特征結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果進(jìn)一步說明LlHsf1基因?qū)儆谥参颒sfC1的同源基因,將其命名為L(zhǎng)lHsfC1.

    2.2 百合LlHsfC1亞細(xì)胞定位

    用基因槍將構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA1300-LlHsfC1-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,空載pCAMBIA1300-GFP為對(duì)照,通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的信號(hào).結(jié)果(圖4)顯示,轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-GFP載體的洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,在細(xì)胞核中檢測(cè)到了LlHsfC1-GFP融合蛋白的熒光信號(hào),表明LlHsfC1主要在細(xì)胞核中表達(dá),具備轉(zhuǎn)錄因子的基本特征,這與LlHsfC1蛋白含有NLS區(qū)域的特征相符.

    2.3 百合LlHsfC1基因的表達(dá)分析

    利用qPCR檢測(cè)LlHsfC1的表達(dá).結(jié)果表明,LlHsfC1的表達(dá)受37 ℃和42 ℃熱激誘導(dǎo),在1~12 h內(nèi)百合葉片中LlHsfC1的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);與42 ℃相比,37 ℃熱脅迫處理更能顯著促進(jìn)LlHsfC1的持續(xù)表達(dá),處理6 h的表達(dá)量約為對(duì)照的5.70倍(P<0.05)(圖5,A).常溫條件下,CaCl2或EGTA處理的LlHsfC1的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照差異不顯著(P>0.05);37 ℃熱脅迫下,CaCl2處理顯著促進(jìn)了LlHsfC1的表達(dá)(P<0.05),而EGTA處理則顯著抑制了LlHsfC1的表達(dá)(P<0.05)(圖5,B),表明LlHsfC1可以通過Ca2+信號(hào)途徑參與百合的熱脅迫反應(yīng).

    標(biāo)尺表示進(jìn)化距離.節(jié)點(diǎn)處數(shù)值表示bootstrap驗(yàn)證中基于1000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比(%).At:Arabidopsis thaliana擬南芥;Ll:Lilium longiflorum百合;Ma:Musa acuminate小果野蕉;Ac:Ananas comosus鳳梨;Eg:Elaeis guineensis油棕;Pd:Phoenix dactylifera海棗.圖3 百合Hsf與其他植物Hsf系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LlHsf with other plant Hsf

    圖4 LlHsfC1在洋蔥表皮中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of LlHsfC1 in onion epidermal cells

    2.4 pCAMBIA1301-LlHsfC1植物過表達(dá)載體的構(gòu)建

    利用雙酶切方法構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LlHsfC1,利用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和SalⅠ將載體切為2個(gè)片段,分別為13 246和786 bp,表明載體構(gòu)建成功.

    3 討論

    目前的研究表明,植物響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控途徑主要有[14]:熱激轉(zhuǎn)錄因子—熱激蛋白(HSF-HSP)途徑、鈣離子—鈣調(diào)蛋白(Ca2+-CaM)途徑、活性氧(ROS)途徑、激素調(diào)控途徑和細(xì)胞未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)途徑.其中,HSF-HSP途徑是植物響應(yīng)熱脅迫的基本和主要途徑.Hsf的功能與其特殊的蛋白結(jié)構(gòu)密不可分,其主要包括以下幾個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域[4]:DBD、OD、NLS、NES和激活域(activator domain, AD).N端的DBD負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合HSE;OD由HR-A/B組成,負(fù)責(zé)Hsf在逆境下形成有活性的同源三聚體,根據(jù)OD結(jié)構(gòu)的特征,可將植物Hsfs分為A、B、C三類,A類在HR-A和HR-B之間存在21個(gè)氨基酸的插入,C類在此區(qū)域存在7個(gè)氨基酸的插入,而B類在此區(qū)域無氨基酸插入;NLS與OD的C端相鄰,是蛋白輸入核內(nèi)所必需的;AD位于C端,它是Hsf中最不保守的部分,其中存在AHA模序,具有轉(zhuǎn)錄激活功能,B類與C類Hsf缺少此結(jié)構(gòu)域;有些Hsf的C末端還具有富含亮氨酸的NES,與蛋白向核外輸出密切相關(guān).本研究的LlHsf1在HR-A和HR-B之間插入了7個(gè)氨基酸殘基,不含AHA和NES模序,與HsfC1的同源性較高,因此將其命名為L(zhǎng)lHsfC1.LlHsfC1在細(xì)胞核中表達(dá),這與其只有NLS的結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果相符,可能行使轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄輔激活功能.但是與百合的5個(gè)A類Hsf相比[8-11],LlHsfC1缺少AHA模序,其是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能,還需要進(jìn)一步研究.

    *表示各點(diǎn)與對(duì)照的表達(dá)量在P<0.05水平差異顯著;A.葉片LlHsfC1在37 ℃和42 ℃熱激處理下的表達(dá);B.葉片LlHsfC1受Ca2+處理的表達(dá).圖5 LlHsfC1在百合中的表達(dá)模式分析Fig.5 Analysis of the expression pattern of LlHsfC1 in lily

    M:1 kb DNA Ladder Marker;A:SmaⅠ/SalⅠ酶切片段.圖6 pCAMBIA1301-LlHsfC1的酶切鑒定Fig.6 Restriction enzyme digestion of pCAMBIA1301-LlHsfC1

    A類Hsf含有AHA模序而通常具有轉(zhuǎn)錄激活活性.因此,對(duì)于植物Hsfs的研究多集中在A類Hsf上:與野生型相比,擬南芥hsfa1a/b/d/e四突變體對(duì)高溫更加敏感,相關(guān)熱響應(yīng)基因表達(dá)顯著下調(diào)[5];番茄HsfA2嚴(yán)格受熱激誘導(dǎo),它在熱脅迫和恢復(fù)循環(huán)中具有較高的激活潛力,并且能誘導(dǎo)Hsp的連續(xù)積累[6];大豆GmHsfA1轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性明顯高于野生型[7];擬南芥中過表達(dá)百合LlHsfA3a增強(qiáng)了植株的基礎(chǔ)和獲得耐熱性,而過表達(dá)LlHsadfA3b提高了植株的獲得耐熱性[11].近年來,越來越多的證據(jù)表明植物B類和C類Hsfs在植物響應(yīng)高溫脅迫的過程中也發(fā)揮著重要作用.番茄HsfB1是HsfA1的共激活因子,具有輔助激活的功能[15],但擬南芥HsfB1卻是A類Hsf的共抑制因子[16].小麥B2亞家族Hsf基因TaHsf3的表達(dá)受熱激誘導(dǎo),在擬南芥中過量表達(dá)TaHsf3可提高擬南芥Hsp70的表達(dá)水平并顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性[17].雙子葉植物中C類Hsfs一般由1~2個(gè)成員組成,如擬南芥、楊樹、番茄均含有1個(gè),而單子葉植物一般由3~5個(gè)成員組成,如水稻含有4個(gè),玉米含有5個(gè)[18].單子葉植物中C類Hsfs更具復(fù)雜性,暗示C類Hsfs在單子葉植物中扮演更重要的角色.例如水稻OsHsfC1b[19]、大白菜C類Hsf基因BraHsf039[20]、小麥TaHsfC2a受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),TaHsfC2a能夠轉(zhuǎn)錄激活一些熱響應(yīng)基因的表達(dá),提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐熱性[21].本研究中,LlHsfC1的表達(dá)受熱激誘導(dǎo),但與42 ℃的脅迫溫度相比,LlHsfC1對(duì)37 ℃的響應(yīng)更加迅速、顯著和持久,這與對(duì)LlHsfA3a和LlHsfA3b的研究結(jié)果類似[11].Zhou et al[22]提出了植物熱激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ca2+-CaM-HSF途徑.在前期研究中表明,Ca2+/LlCaM3可能在HsfA1的上游調(diào)控百合耐熱性[2].因此研究了CaCl2、鈣離子螯合劑EGTA處理對(duì)LlHsfC1表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)LlHsfC1的表達(dá)受熱脅迫與Ca2+處理協(xié)同誘導(dǎo),表明LlHsfC1也可能通過Ca2+信號(hào)途徑參與百合的HSR.

    亞細(xì)胞定位與基因表達(dá)的結(jié)果表明LlHsfC1可能與百合的HSR密切相關(guān),但是還需要進(jìn)一步在模式植物和百合上分析基因功能.本研究構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LlHsfC1,為后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因來研究LlHsfC1的功能奠定了基礎(chǔ).

    猜你喜歡
    耐熱性擬南芥百合
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    風(fēng)吹百合香
    清心消暑話百合
    尿黑酸對(duì)擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    百合依依
    兩種LED光源作為擬南芥生長(zhǎng)光源的應(yīng)用探究
    耐熱性能優(yōu)異的鋁合金
    鋁加工(2017年1期)2017-03-07 00:53:33
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制探究
    退火對(duì)聚乳酸結(jié)晶及耐熱性能的影響
    誤區(qū):耐熱性好,維生素E不會(huì)損失
    女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩强制内射视频| 熟女电影av网| 欧美激情久久久久久爽电影| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 麻豆国产av国片精品| av在线天堂中文字幕| 国产三级中文精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一进一出抽搐动态| 综合色av麻豆| 舔av片在线| 亚洲自偷自拍三级| 最新中文字幕久久久久| 亚洲美女黄片视频| 91久久精品电影网| 悠悠久久av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜爱爱视频在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产男人的电影天堂91| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 91av网一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩欧美 国产精品| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲色图av天堂| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 午夜激情欧美在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 成年免费大片在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 99在线视频只有这里精品首页| 简卡轻食公司| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美日韩高清专用| 少妇人妻精品综合一区二区 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲精品色激情综合| 九九热线精品视视频播放| 亚洲熟妇熟女久久| 波多野结衣高清作品| 日日撸夜夜添| 草草在线视频免费看| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本 av在线| 亚洲精品成人久久久久久| av国产免费在线观看| avwww免费| 精品乱码久久久久久99久播| 男女边吃奶边做爰视频| 国国产精品蜜臀av免费| АⅤ资源中文在线天堂| 久久久精品94久久精品| 日韩精品有码人妻一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| av天堂在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久亚洲精品不卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久午夜电影| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久午夜福利片| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲成人久久爱视频| 桃色一区二区三区在线观看| 色av中文字幕| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 赤兔流量卡办理| 国产成人一区二区在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av.在线天堂| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一a级毛片在线观看| 成人国产麻豆网| 97超视频在线观看视频| 亚洲av成人av| 亚洲av成人av| 我要搜黄色片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 人妻少妇偷人精品九色| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精品456在线播放app| 性欧美人与动物交配| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av在线亚洲专区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费观看在线日韩| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产成人精品久久久久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| eeuss影院久久| 草草在线视频免费看| 哪里可以看免费的av片| 淫秽高清视频在线观看| 69av精品久久久久久| 久久久国产成人免费| 1024手机看黄色片| 国产精品一区www在线观看| 国产精品伦人一区二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 美女免费视频网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久国产a免费观看| 中国国产av一级| 一个人观看的视频www高清免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久99久视频精品免费| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲三级黄色毛片| av在线亚洲专区| 国产视频一区二区在线看| 又粗又爽又猛毛片免费看| eeuss影院久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产高清有码在线观看视频| 国产精华一区二区三区| 国内精品宾馆在线| aaaaa片日本免费| 亚洲图色成人| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成人一区二区在线| 免费av不卡在线播放| 两个人的视频大全免费| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲18禁久久av| 我要搜黄色片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av女优亚洲男人天堂| 国产69精品久久久久777片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜视频国产福利| 成人亚洲欧美一区二区av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品av视频在线免费观看| a级毛片免费高清观看在线播放| av在线播放精品| 成人性生交大片免费视频hd| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本成人三级电影网站| 国产精品无大码| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美激情在线99| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 天堂动漫精品| 久久综合国产亚洲精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99热这里只有是精品在线观看| 成人综合一区亚洲| 欧美激情久久久久久爽电影| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲精品国产成人久久av| 99久国产av精品国产电影| 成年女人毛片免费观看观看9| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲av五月六月丁香网| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av免费在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线免费观看不下载黄p国产| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩国内少妇激情av| 一区二区三区高清视频在线| 国产高清激情床上av| 深爱激情五月婷婷| 99久国产av精品国产电影| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久综合国产亚洲精品| 最近的中文字幕免费完整| 久久久久久久亚洲中文字幕| 在线观看66精品国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲18禁久久av| videossex国产| 极品教师在线视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产清高在天天线| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久99热6这里只有精品| 99久久精品一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 一a级毛片在线观看| 观看美女的网站| 久久精品国产亚洲网站| 99热精品在线国产| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品国产高清国产av| 久久精品人妻少妇| 黑人高潮一二区| 欧美激情在线99| 午夜激情欧美在线| 免费人成在线观看视频色| 在线观看66精品国产| 成人国产麻豆网| 听说在线观看完整版免费高清| 国产人妻一区二区三区在| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 三级经典国产精品| 黄片wwwwww| 久久6这里有精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品人妻熟女av久视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 我的老师免费观看完整版| 高清日韩中文字幕在线| 欧美成人a在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 我的老师免费观看完整版| 美女黄网站色视频| 久久午夜福利片| 人妻久久中文字幕网| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 两个人的视频大全免费| 久久久久久久久大av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲美女搞黄在线观看 | 丝袜美腿在线中文| 美女高潮的动态| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av.av天堂| 99riav亚洲国产免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品国产高清国产av| 五月伊人婷婷丁香| 日本免费a在线| 性欧美人与动物交配| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 香蕉av资源在线| 一本久久中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 三级经典国产精品| 日韩精品有码人妻一区| 岛国在线免费视频观看| 免费看日本二区| 日韩精品中文字幕看吧| eeuss影院久久| 男女之事视频高清在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产探花极品一区二区| 成人三级黄色视频| 精品免费久久久久久久清纯| 91精品国产九色| 婷婷亚洲欧美| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲国产精品久久男人天堂| 看十八女毛片水多多多| 久久这里只有精品中国| 69av精品久久久久久| 国产久久久一区二区三区| 免费av不卡在线播放| 香蕉av资源在线| 国内精品宾馆在线| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| a级毛片a级免费在线| 高清毛片免费观看视频网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产老妇女一区| 99热网站在线观看| 一本久久中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 男女边吃奶边做爰视频| 久久人人爽人人片av| 中国美白少妇内射xxxbb| 深夜a级毛片| 丝袜美腿在线中文| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久精品91蜜桃| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 青春草视频在线免费观看| 九九在线视频观看精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩亚洲欧美综合| 国产探花在线观看一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲av成人av| 国产中年淑女户外野战色| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲五月天丁香| 成人美女网站在线观看视频| 男人舔奶头视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲人成网站在线播| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 最近的中文字幕免费完整| 内射极品少妇av片p| 欧美日韩精品成人综合77777| 两个人视频免费观看高清| 成熟少妇高潮喷水视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜激情欧美在线| 18+在线观看网站| avwww免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 看片在线看免费视频| 色在线成人网| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲无线在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 免费观看在线日韩| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 美女黄网站色视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 免费av毛片视频| 99久久精品热视频| 国产精品无大码| 在线观看免费视频日本深夜| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 搞女人的毛片| 我的老师免费观看完整版| av国产免费在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩强制内射视频| 国产精品伦人一区二区| av天堂中文字幕网| 少妇的逼好多水| 国产精品一二三区在线看| 看免费成人av毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 国内精品一区二区在线观看| 国产高清激情床上av| 最近手机中文字幕大全| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美日韩在线观看h| 免费人成视频x8x8入口观看| 天堂影院成人在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 我要搜黄色片| 内地一区二区视频在线| 国产极品精品免费视频能看的| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲人成网站在线播| 老熟妇仑乱视频hdxx| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产在线精品亚洲第一网站| 日本五十路高清| 美女内射精品一级片tv| 亚洲丝袜综合中文字幕| 免费看a级黄色片| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美最黄视频在线播放免费| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲四区av| 亚洲成av人片在线播放无| 成人国产麻豆网| 国产真实乱freesex| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 毛片女人毛片| 内射极品少妇av片p| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久午夜亚洲精品久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 色在线成人网| 春色校园在线视频观看| 尾随美女入室| av免费在线看不卡| 99热全是精品| 一级黄色大片毛片| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线观看av片永久免费下载| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲欧美清纯卡通| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 天天躁日日操中文字幕| 91狼人影院| 国产成人福利小说| 直男gayav资源| 色在线成人网| 亚洲国产色片| 成年版毛片免费区| 久久久精品94久久精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品一区av在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 一个人看视频在线观看www免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 一区二区三区高清视频在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国内精品宾馆在线| 久久精品国产亚洲av涩爱 | a级毛片a级免费在线| 国产 一区 欧美 日韩| 人人妻人人澡欧美一区二区| 禁无遮挡网站| 特级一级黄色大片| 97在线视频观看| 亚洲在线观看片| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲专区国产一区二区| 日韩欧美免费精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| www日本黄色视频网| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费搜索国产男女视频| 色5月婷婷丁香| 久久精品影院6| 直男gayav资源| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲国产精品sss在线观看| 最近手机中文字幕大全| 午夜福利在线观看吧| 看黄色毛片网站| 亚州av有码| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一级a爱片免费观看的视频| 国产中年淑女户外野战色| 在线a可以看的网站| 欧美日韩乱码在线| 久久久久久久久中文| 亚洲av免费在线观看| 成年av动漫网址| 婷婷精品国产亚洲av在线| 在现免费观看毛片| 免费无遮挡裸体视频| 久久综合国产亚洲精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久中文看片网| 亚洲图色成人| 日韩欧美精品v在线| 午夜爱爱视频在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 久久久精品欧美日韩精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲专区国产一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 97超视频在线观看视频| 日本在线视频免费播放| 日韩中字成人| 男人狂女人下面高潮的视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久九九热精品免费| 在线a可以看的网站| 欧美成人a在线观看| 久久久久国产网址| 听说在线观看完整版免费高清| 波多野结衣巨乳人妻| 99在线人妻在线中文字幕| 国产高清三级在线| 久久这里只有精品中国| 91精品国产九色| 色在线成人网| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久热精品热| av女优亚洲男人天堂| 永久网站在线| 午夜福利视频1000在线观看| 免费av不卡在线播放| 嫩草影院入口| h日本视频在线播放| 两个人视频免费观看高清| 免费看光身美女| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文资源天堂在线| 久久久精品94久久精品| 亚洲在线观看片| 亚洲精品色激情综合| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 香蕉av资源在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| www.色视频.com| 久久久久精品国产欧美久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产久久久一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 精品久久久久久成人av| eeuss影院久久| 午夜福利成人在线免费观看| 久久精品国产自在天天线| 国产精品一二三区在线看| 国产乱人视频| 51国产日韩欧美| 精品人妻偷拍中文字幕| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| ponron亚洲| 麻豆国产av国片精品| 欧美一区二区精品小视频在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 不卡一级毛片| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 一级黄片播放器| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久九九精品影院| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 黄色配什么色好看| 男女之事视频高清在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 婷婷亚洲欧美| 69av精品久久久久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 免费搜索国产男女视频| 在线观看66精品国产| 日本一二三区视频观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲国产色片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 麻豆国产av国片精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲最大成人手机在线| 在线观看66精品国产| 97热精品久久久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久热精品热| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷精品国产亚洲av在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| a级毛色黄片| 精华霜和精华液先用哪个| 校园春色视频在线观看| 99热网站在线观看| 亚洲在线自拍视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美高清成人免费视频www| 一级毛片久久久久久久久女| 免费看光身美女| 美女内射精品一级片tv| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 精品久久久久久久久亚洲| 晚上一个人看的免费电影| 久久久成人免费电影| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 最近手机中文字幕大全| 亚洲电影在线观看av| 国产淫片久久久久久久久| 久久精品人妻少妇| 欧美中文日本在线观看视频| 草草在线视频免费看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲成av人片在线播放无| а√天堂www在线а√下载| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久午夜亚洲精品久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 人妻久久中文字幕网| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久久大精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 日本黄色视频三级网站网址| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 内地一区二区视频在线| 亚州av有码| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 午夜福利视频1000在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品一区二区免费观看| 免费观看精品视频网站|