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    百合熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LlHsfC1的鑒定、表達(dá)與亞細(xì)胞定位

    2019-01-25 05:46:22隋娟娟何俊娜于守超義鳴放
    關(guān)鍵詞:耐熱性擬南芥百合

    曹 興, 易 瑾, 隋娟娟, 吳 澤, 何俊娜, 于守超, 趙 燕, 義鳴放

    (1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東 聊城 252059;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽 阜陽(yáng) 236037;4.北京師范大學(xué)附屬中學(xué)平谷第一分校,北京 101204)

    百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉,具有重要的觀賞、食藥用價(jià)值.百合屬的大多數(shù)種及品種性喜冷涼、濕潤(rùn)氣候,耐熱性較差.目前,國(guó)內(nèi)主栽的百合品種生育的適溫為16~24 ℃,30 ℃以上時(shí),生育受到嚴(yán)重抑制[1].然而我國(guó)大部分地區(qū)夏季炎熱,高溫造成百合生長(zhǎng)停滯、植株矮小、少花盲花、莖桿軟、病蟲害嚴(yán)重等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響切花的產(chǎn)量和質(zhì)量,并造成種球退化,制約著我國(guó)百合商品化周年生產(chǎn)[2].所以,提高百合耐熱性是解決這一問題的關(guān)鍵.

    高溫脅迫下,植物體內(nèi)迅速合成熱激蛋白(heat shock protein, Hsp),Hsp的大量積累,可作為分子伴侶協(xié)助其他相關(guān)蛋白的重新折疊、穩(wěn)定、運(yùn)輸和降解,維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)高溫的耐受力,從而提高植物的耐熱性.熱激蛋白的表達(dá)受熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)的調(diào)控.熱脅迫下,Hsf特異結(jié)合在Hsp基因的熱激元件(heat shock element, HSE)上,并募集其他轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,導(dǎo)致Hsp基因的轉(zhuǎn)錄和Hsp的積累[3].根據(jù)寡聚域(oligomerization domian, OD)結(jié)構(gòu)的不同,Hsf可分為HsfA、HsfB 和HsfC三類,A類Hsf含有激活模序(aromatic, large hydrophobic and acidic amino residues, AHA)具有轉(zhuǎn)錄激活活性,而B類和C類則缺少AHA[4].目前,研究較多、功能較為明確的是A類Hsf[5-7],C類Hsf的研究較少.在前期研究中,從百合中分離得到了5個(gè)A類Hsf基因LlHsfA1[8]、LlHsfA2a[9]、LlHsfA2b[10]、LlHsfA3a和LlHsfA3b[11],研究表明它們參與了百合的熱激反應(yīng)(heat shock response, HSR).

    在百合野生種中,麝香百合(LiliumlongiflorumThunb)的耐熱性較強(qiáng),它們的雜交品種也具有較強(qiáng)的耐熱性.本研究從麝香百合雜種系‘白天堂’中鑒定了C類熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LlHsfC1,研究它與百合耐熱性的關(guān)系,進(jìn)一步豐富百合Hsf參與的熱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò).通過解析耐熱百合品種的高溫逆境響應(yīng)機(jī)制,鑒定調(diào)控耐熱性的關(guān)鍵基因,對(duì)于采用分子育種手段來提高現(xiàn)有主栽百合品種的耐熱性具有重要的理論和實(shí)踐意義.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)材料為麝香百合(Liliumlongiflorum)品種‘白天堂’(‘White Heaven’)組培苗,保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.亞細(xì)胞定位使用的材料為紫皮洋蔥(Alliumcepa),購(gòu)買于超市.

    表1 PCR引物1)Table 1 Primers applied in PCR

    1)下劃線表示酶切位點(diǎn).

    試驗(yàn)所用的RNA提取試劑盒、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體、T4連接酶、SalⅠ、SpeⅠ、SmaⅠ等購(gòu)自TaKaRa公司;熒光定量試劑盒SYBR FAST qPCR Universal Kit購(gòu)自KAPA公司;卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)購(gòu)自Sigma公司;其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純;擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1);DNA測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成.

    1.2 百合HsfC1基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

    根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的百合LlHsf1(AEU17861)的氨基酸序列,進(jìn)行BLAST比對(duì),選擇相似度較高的同源蛋白,用DNAMAN 5軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析.用EXPASY (https://www.expasy.org/tools/)中的ProtParam、SMART、PSORT、NetPhos等在線工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析;用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

    1.3 LlHsfC1蛋白亞細(xì)胞定位分析

    利用DNAMAN 5分析LlHsfC1的ORF序列的酶切位點(diǎn),結(jié)合pCAMBIA1300-GFP載體,選用SalⅠ和SpeⅠ作為融合表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn),并設(shè)計(jì)上游特異引物SPF1和下游特異引物SPR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增.雙酶切pCAMBIA1300-GFP空載質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接,獲得pCAMBIA1300-LlHsfC1-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體,雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證連接是否成功.用基因槍轟擊法[12]將構(gòu)建好的重組瞬時(shí)表達(dá)載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24 h的洋蔥表皮細(xì)胞中,空載作為對(duì)照.暗培養(yǎng)24 h后在激光共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)下進(jìn)行觀察和拍照,并用EZ-C1軟件對(duì)照片進(jìn)行分析和處理.

    1.4 LlHsfC1基因表達(dá)分析

    選擇生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的‘白天堂’組培苗作為基因表達(dá)分析的材料.

    LlHsfC1在熱激處理下的表達(dá):用37和42 ℃熱激處理百合組培苗,分別在處理1、3、6、12 h取葉片,以22 ℃處理為對(duì)照.

    LlHsfC1在Ca2+處理下的表達(dá):分別在22和37 ℃下,分別用20 mmol·L-1CaCl2和10 mmmol·L-1EGTA溶液浸沒百合組培苗的根部,用去離子水處理作對(duì)照,處理1 h后取葉片.

    所取組織用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用提取RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)的方法檢測(cè)基因的表達(dá),步驟參照KAPA SYBR FAST qPCR Universal Kit熒光定量試劑盒說明書,儀器為Applied Biosystems Step One System 熒光定量PCR儀.LlHsfC1的擴(kuò)增引物為qF1和qR1,內(nèi)參基因18S rRNA的擴(kuò)增引物為18SqF和18SqR.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min;95 ℃ 3 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán).每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),采用2-ΔΔCT法[13]分析基因的相對(duì)表達(dá)量.

    1.5 植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LlHsfC1的構(gòu)建

    利用DNAMAN 5分析LlHsfC1的ORF序列的酶切位點(diǎn),結(jié)合pCAMBIA1301載體,選用SmaⅠ和SalⅠ作為融合表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn).以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)上游特異引物SPF2和下游特異引物SPR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后連接到pMD18-T載體.雙酶切pCAMBIA1301空載質(zhì)粒和pMD18-T-LlHsfC1質(zhì)粒,純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接,獲得pCAMBIA1301-LlHsfC1過表達(dá)載體,雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證連接是否成功.測(cè)序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)植物轉(zhuǎn)基因研究.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 百合LlHsfC1基因鑒定及生物信息學(xué)分析

    LlHsf1(GenBank登錄號(hào)JN792932)ORF區(qū)序列長(zhǎng)為780 bp,編碼259個(gè)氨基酸(圖1).BLAST的結(jié)果顯示,該基因與其他物種的HsfC1基因有較高的同源性,暫將其命名為L(zhǎng)lHsfC1.

    圖1 百合LlHsfC1基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame of LlHsfC1 and the predicted amino acid sequences

    ProtParam在線工具預(yù)測(cè)百合LlHsfC1蛋白包含259個(gè)氨基酸殘基,分子式為C1350H2107N381O385S9,分子質(zhì)量為30.1 ku.親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.536(<0),屬于親水性蛋白,不穩(wěn)定系數(shù)為64.28(>40),屬于不穩(wěn)定蛋白,理論等電點(diǎn)(PI)為9.61,屬于堿性蛋白.蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具NetPhos預(yù)測(cè)LlHsfC1含有22個(gè)絲氨酸(Ser)和6個(gè)蘇氨酸(Thr)潛在磷酸化位點(diǎn).蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位工具PSORT預(yù)測(cè)LlHsfC1定位于細(xì)胞核內(nèi).

    將LlHsfC1及與其相似度較高的其他植物的HsfC1氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì),利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具SMART進(jìn)行分析,結(jié)果表明LlHsfC1蛋白具有C類Hsf的典型結(jié)構(gòu)(圖2A):在靠近N端18~109個(gè)氨基酸殘基形成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, DBD);第124~167個(gè)氨基酸殘基形成OD,該寡聚域主要由兩段疏水性氨基酸殘基(hydrophobic amino acid residues A/B, HR-A/B)組成;第178~191個(gè)氨基酸殘基形成核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS).與百合A類熱激轉(zhuǎn)錄因子LlHsfA1、LlHsfA2a相比,LlHsfC1缺少AHA模序和核輸出信號(hào)(nuclear export signal, NES)(圖2B).

    LlHsfC1:Lilium longiflorum百合AEU17861;AcHsfC1:Ananas comosus鳳梨XP_020098172;AtHsfC1:Arabidopsis thaliana擬南芥At3g24520;EgHsfC1:Elaeis guineensis油棕XP_010911318;MaHsfC1:Musa acuminata小果野蕉XP_009415170;PdHsfC1:Phoenix dactylifera海棗XP_008810034.A.百合LlHsfC1與其他植物HsfC1氨基酸序列同源比對(duì);B.百合LlHsfC1與LlHsfA1、LlHsfA2a基本結(jié)構(gòu)比較.圖2 百合LlHsfC1的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Basic structure of LlHsfC1

    將百合LlHsfC1及與其同源性較高的其他植物的HsfC1、擬南芥21個(gè)Hsf的氨基酸序列,用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示Hsf家族可分為A、B、C三類,百合LlHsfC1歸屬C類.LlHsfC1與同為單子葉植物的海棗(Phoenixdactylifera)HsfC1的親緣關(guān)系最近(圖3),相似度達(dá)60%.特征結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果進(jìn)一步說明LlHsf1基因?qū)儆谥参颒sfC1的同源基因,將其命名為L(zhǎng)lHsfC1.

    2.2 百合LlHsfC1亞細(xì)胞定位

    用基因槍將構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA1300-LlHsfC1-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,空載pCAMBIA1300-GFP為對(duì)照,通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的信號(hào).結(jié)果(圖4)顯示,轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-GFP載體的洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,在細(xì)胞核中檢測(cè)到了LlHsfC1-GFP融合蛋白的熒光信號(hào),表明LlHsfC1主要在細(xì)胞核中表達(dá),具備轉(zhuǎn)錄因子的基本特征,這與LlHsfC1蛋白含有NLS區(qū)域的特征相符.

    2.3 百合LlHsfC1基因的表達(dá)分析

    利用qPCR檢測(cè)LlHsfC1的表達(dá).結(jié)果表明,LlHsfC1的表達(dá)受37 ℃和42 ℃熱激誘導(dǎo),在1~12 h內(nèi)百合葉片中LlHsfC1的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);與42 ℃相比,37 ℃熱脅迫處理更能顯著促進(jìn)LlHsfC1的持續(xù)表達(dá),處理6 h的表達(dá)量約為對(duì)照的5.70倍(P<0.05)(圖5,A).常溫條件下,CaCl2或EGTA處理的LlHsfC1的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照差異不顯著(P>0.05);37 ℃熱脅迫下,CaCl2處理顯著促進(jìn)了LlHsfC1的表達(dá)(P<0.05),而EGTA處理則顯著抑制了LlHsfC1的表達(dá)(P<0.05)(圖5,B),表明LlHsfC1可以通過Ca2+信號(hào)途徑參與百合的熱脅迫反應(yīng).

    標(biāo)尺表示進(jìn)化距離.節(jié)點(diǎn)處數(shù)值表示bootstrap驗(yàn)證中基于1000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比(%).At:Arabidopsis thaliana擬南芥;Ll:Lilium longiflorum百合;Ma:Musa acuminate小果野蕉;Ac:Ananas comosus鳳梨;Eg:Elaeis guineensis油棕;Pd:Phoenix dactylifera海棗.圖3 百合Hsf與其他植物Hsf系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LlHsf with other plant Hsf

    圖4 LlHsfC1在洋蔥表皮中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of LlHsfC1 in onion epidermal cells

    2.4 pCAMBIA1301-LlHsfC1植物過表達(dá)載體的構(gòu)建

    利用雙酶切方法構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LlHsfC1,利用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和SalⅠ將載體切為2個(gè)片段,分別為13 246和786 bp,表明載體構(gòu)建成功.

    3 討論

    目前的研究表明,植物響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控途徑主要有[14]:熱激轉(zhuǎn)錄因子—熱激蛋白(HSF-HSP)途徑、鈣離子—鈣調(diào)蛋白(Ca2+-CaM)途徑、活性氧(ROS)途徑、激素調(diào)控途徑和細(xì)胞未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)途徑.其中,HSF-HSP途徑是植物響應(yīng)熱脅迫的基本和主要途徑.Hsf的功能與其特殊的蛋白結(jié)構(gòu)密不可分,其主要包括以下幾個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域[4]:DBD、OD、NLS、NES和激活域(activator domain, AD).N端的DBD負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合HSE;OD由HR-A/B組成,負(fù)責(zé)Hsf在逆境下形成有活性的同源三聚體,根據(jù)OD結(jié)構(gòu)的特征,可將植物Hsfs分為A、B、C三類,A類在HR-A和HR-B之間存在21個(gè)氨基酸的插入,C類在此區(qū)域存在7個(gè)氨基酸的插入,而B類在此區(qū)域無氨基酸插入;NLS與OD的C端相鄰,是蛋白輸入核內(nèi)所必需的;AD位于C端,它是Hsf中最不保守的部分,其中存在AHA模序,具有轉(zhuǎn)錄激活功能,B類與C類Hsf缺少此結(jié)構(gòu)域;有些Hsf的C末端還具有富含亮氨酸的NES,與蛋白向核外輸出密切相關(guān).本研究的LlHsf1在HR-A和HR-B之間插入了7個(gè)氨基酸殘基,不含AHA和NES模序,與HsfC1的同源性較高,因此將其命名為L(zhǎng)lHsfC1.LlHsfC1在細(xì)胞核中表達(dá),這與其只有NLS的結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果相符,可能行使轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄輔激活功能.但是與百合的5個(gè)A類Hsf相比[8-11],LlHsfC1缺少AHA模序,其是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能,還需要進(jìn)一步研究.

    *表示各點(diǎn)與對(duì)照的表達(dá)量在P<0.05水平差異顯著;A.葉片LlHsfC1在37 ℃和42 ℃熱激處理下的表達(dá);B.葉片LlHsfC1受Ca2+處理的表達(dá).圖5 LlHsfC1在百合中的表達(dá)模式分析Fig.5 Analysis of the expression pattern of LlHsfC1 in lily

    M:1 kb DNA Ladder Marker;A:SmaⅠ/SalⅠ酶切片段.圖6 pCAMBIA1301-LlHsfC1的酶切鑒定Fig.6 Restriction enzyme digestion of pCAMBIA1301-LlHsfC1

    A類Hsf含有AHA模序而通常具有轉(zhuǎn)錄激活活性.因此,對(duì)于植物Hsfs的研究多集中在A類Hsf上:與野生型相比,擬南芥hsfa1a/b/d/e四突變體對(duì)高溫更加敏感,相關(guān)熱響應(yīng)基因表達(dá)顯著下調(diào)[5];番茄HsfA2嚴(yán)格受熱激誘導(dǎo),它在熱脅迫和恢復(fù)循環(huán)中具有較高的激活潛力,并且能誘導(dǎo)Hsp的連續(xù)積累[6];大豆GmHsfA1轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性明顯高于野生型[7];擬南芥中過表達(dá)百合LlHsfA3a增強(qiáng)了植株的基礎(chǔ)和獲得耐熱性,而過表達(dá)LlHsadfA3b提高了植株的獲得耐熱性[11].近年來,越來越多的證據(jù)表明植物B類和C類Hsfs在植物響應(yīng)高溫脅迫的過程中也發(fā)揮著重要作用.番茄HsfB1是HsfA1的共激活因子,具有輔助激活的功能[15],但擬南芥HsfB1卻是A類Hsf的共抑制因子[16].小麥B2亞家族Hsf基因TaHsf3的表達(dá)受熱激誘導(dǎo),在擬南芥中過量表達(dá)TaHsf3可提高擬南芥Hsp70的表達(dá)水平并顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性[17].雙子葉植物中C類Hsfs一般由1~2個(gè)成員組成,如擬南芥、楊樹、番茄均含有1個(gè),而單子葉植物一般由3~5個(gè)成員組成,如水稻含有4個(gè),玉米含有5個(gè)[18].單子葉植物中C類Hsfs更具復(fù)雜性,暗示C類Hsfs在單子葉植物中扮演更重要的角色.例如水稻OsHsfC1b[19]、大白菜C類Hsf基因BraHsf039[20]、小麥TaHsfC2a受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá),TaHsfC2a能夠轉(zhuǎn)錄激活一些熱響應(yīng)基因的表達(dá),提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐熱性[21].本研究中,LlHsfC1的表達(dá)受熱激誘導(dǎo),但與42 ℃的脅迫溫度相比,LlHsfC1對(duì)37 ℃的響應(yīng)更加迅速、顯著和持久,這與對(duì)LlHsfA3a和LlHsfA3b的研究結(jié)果類似[11].Zhou et al[22]提出了植物熱激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ca2+-CaM-HSF途徑.在前期研究中表明,Ca2+/LlCaM3可能在HsfA1的上游調(diào)控百合耐熱性[2].因此研究了CaCl2、鈣離子螯合劑EGTA處理對(duì)LlHsfC1表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)LlHsfC1的表達(dá)受熱脅迫與Ca2+處理協(xié)同誘導(dǎo),表明LlHsfC1也可能通過Ca2+信號(hào)途徑參與百合的HSR.

    亞細(xì)胞定位與基因表達(dá)的結(jié)果表明LlHsfC1可能與百合的HSR密切相關(guān),但是還需要進(jìn)一步在模式植物和百合上分析基因功能.本研究構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LlHsfC1,為后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因來研究LlHsfC1的功能奠定了基礎(chǔ).

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