X連鎖中性粒細(xì)胞減少癥1例報(bào)告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

孟 新 侯 佳 王 瑩 劉俐嬪 劉璐瑤 劉丹如 孫金嶠 王曉川

1 病例報(bào)告

男，6歲5月，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞減少6年余，為求進(jìn)一步診治，于2018年4月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)臨床免疫科。

既往史：患兒3月齡時(shí)因發(fā)熱查血常規(guī)，首次發(fā)現(xiàn)WBC及中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(ANC)減少，其后6年間斷隨訪血常規(guī)，WBC及ANC始終低于正常水平?；純浩剿匾壮霈F(xiàn)無(wú)明顯誘因發(fā)熱，頻率約每月1次，熱峰39℃左右，熱型不規(guī)則，對(duì)癥處理后發(fā)熱可緩解；反復(fù)發(fā)生上呼吸道感染、化膿性扁桃體炎、口腔潰瘍，感染病原包括白色念珠菌、EB病毒、肺炎支原體。先后使用多種抗感染藥物，包括阿奇霉素、美羅培南、哌拉西林他唑巴坦、頭孢菌素類(lèi)(包括頭孢哌酮他唑巴坦、頭孢唑肟、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢尼西)，抗感染治療后病情好轉(zhuǎn)。3歲時(shí)于外院行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)，提示骨髓增生活躍低水平，粒系成熟障礙。曾注射重組人集落刺激因子(G-CSF)，效果不詳。無(wú)乙肝、結(jié)核、傷寒等傳染病史及其接觸史，有芒果過(guò)敏史，無(wú)藥物過(guò)敏史，無(wú)手術(shù)外傷史，無(wú)異物吸入史。

個(gè)人史：G1P1，足月順產(chǎn)，出生體重3.2 kg，Apgar評(píng)分1、5 min均為10分。生后母乳喂養(yǎng)，4月齡起添加雞蛋黃、粥等輔食，現(xiàn)普食，無(wú)挑食、偏食。2個(gè)月會(huì)抬頭，6個(gè)月會(huì)坐，13個(gè)月會(huì)走，智力、體格發(fā)育同正常同齡兒。

預(yù)防接種史：未按時(shí)接種，就診前已全部補(bǔ)種，未見(jiàn)不良反應(yīng)。

家族史：父母體健，非近親婚配，否認(rèn)家族性遺傳性疾病史。

體格檢查：T 36.5℃，P 100·min-1,R 22·min-1，體重21 kg。神志清楚，精神可，發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)中等。全身皮膚未見(jiàn)皮疹、出血點(diǎn)及黃染。淺表淋巴結(jié)未及腫大。外耳道無(wú)分泌液，乳突區(qū)無(wú)壓痛。唇紅，口腔黏膜光滑，咽部充血，雙側(cè)扁桃體I°腫大，充血，無(wú)膿苔。呼吸平穩(wěn)，雙肺呼吸音粗，未聞及啰音。心率100·min-1，律齊，心音有力。腹平軟，未及包塊，肝脾肋下未觸及，腸鳴音2～3·min-1。四肢末端溫，脊柱、四肢無(wú)畸形?？耸险?、布氏征、巴氏征陰性。

實(shí)驗(yàn)室檢查：2017年8月17日至2018年5月30日共行21次血常規(guī)檢查，其中WBC(2.15±0.5)×109·L-1，ANC(0.261±0.086)×109·L-1，患兒于2018年4月29日至5月30日每2周隨訪血常規(guī)，ANC未見(jiàn)周期性波動(dòng)(圖1)。淋巴細(xì)胞亞群分類(lèi)計(jì)數(shù)示NK細(xì)胞減少(23.42×109·L-1，1.63%)。骨髓細(xì)胞學(xué)染色(圖2)：骨髓有核細(xì)胞增生活躍低水平，粒紅比為1.4∶1；粒系增生伴成熟障礙，部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒增粗或可見(jiàn)空泡；紅系及淋巴系細(xì)胞增生活躍，形態(tài)無(wú)明顯異常；巨核細(xì)胞易見(jiàn)，血小板不少，簇狀易見(jiàn)。

根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)，ANC減少、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，臨床懷疑先天性中性粒細(xì)胞減少癥。外院血液遺傳疾病基因篩查，提示W(wǎng)AS基因突變，致病性不確定。為進(jìn)一步明確診斷，經(jīng)患兒家長(zhǎng)同意，對(duì)患兒及其父母進(jìn)行WAS基因檢測(cè)。

圖1 WBC和ANC波動(dòng)圖

圖2骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色(瑞氏染色，×1000)示粒系成熟障礙

注 紅色箭頭示早幼粒細(xì)胞和中幼粒細(xì)胞

WAS基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證：取患兒及父母新鮮肝素抗凝血各2 mL，用FlexiGene DNA Kit抽提全血基因組DNA，測(cè)DNA濃度約100 ng·μL-1，設(shè)計(jì)WASexon8-exon9上下游PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增WAS基因，HiSeq2000進(jìn)行Sanger測(cè)序，F(xiàn)inchTV軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析(圖3)。患兒X染色體9號(hào)外顯子c.T881C(p.I294T)半合子變異，其母為攜帶者，其父該位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)變異。

WASmRNA檢測(cè)：取患兒及父母新鮮肝素抗凝血各2 mL，分離PBMC(人外周血淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津?yàn)笊?，Trizol法提取總RNA并檢測(cè)RNA濃度后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(PrimeScriptTMRT Master Mix，Takara)，設(shè)計(jì)qPCR引物(Forward Primer 5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’; Reverse primer 5’-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3’)，qPCR采用Takara TerraTMqPCR Direct SYBR?Premix推薦方案，Roche Light Cycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)患兒及其父母WAS基因mRNA表達(dá)水平。以患兒父親為正常對(duì)照，將其qPCR結(jié)果2-△△Ct設(shè)為1，母親(攜帶者)為正常對(duì)照的0.60倍，患兒僅為正常對(duì)照的0.29倍，表明WAS基因p.I294T變異導(dǎo)致患兒該基因轉(zhuǎn)錄相對(duì)減少，攜帶者母親的mRNA表達(dá)水平亦下降。

圖3家系Sanger測(cè)序結(jié)果

注 黃色標(biāo)記顯示患兒c.T881C:p.I294T半合子變異，其母為攜帶者，其父該位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)變異

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WASP表達(dá)：取患兒、患兒母親及健康人新鮮血各1管，肝素抗凝分離PBMC，F(xiàn)ACS buffer洗滌后與CD3抗體4℃孵育20 min，F(xiàn)ACS buffer洗滌，加入250 μL FACS Staining Buffer重懸混勻，加入500 μL Cytofix/Cytoperm置于4℃反應(yīng)30 min，Perm/Wash液洗滌，50 μL Perm/Wash液重懸后加入WASP抗體，4℃反應(yīng)20 min，Perm/Wash液終止染色并洗滌，200 μL FACS buffer重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)WASP表達(dá)，F(xiàn)lowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖4顯示，患兒、母親及正常對(duì)照細(xì)胞內(nèi)WASP表達(dá)水平分別為74.5%、84.3%和93.7%。

圖4患兒及其母親WASP表達(dá)

注 A圖為設(shè)門(mén)方法，B圖為患兒、其母親和正常對(duì)照的WASP表達(dá)結(jié)果

治療與隨訪：患兒入我院后感染癥狀不明顯，ANC低，予粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)后ANC可從0.14×109·L-1上升至1.25×109·L-1，最高可升至3.32×109·L-1，隨訪1周后外周血ANC再次下降。隨訪至2018年9月，患兒病情穩(wěn)定，發(fā)熱和感染次數(shù)減少，外周血常規(guī)ANC(0.17～0.33)×109·L-1。

2 文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

檢索PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方和維普數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索時(shí)間從建庫(kù)至2018年9月20日。英文檢索關(guān)鍵詞為“X-linked neutropenia”，檢出542篇；中文檢索關(guān)鍵詞為“X連鎖中性粒細(xì)胞減少癥”，檢出0篇。篩選WAS基因突變導(dǎo)致的XLN病例的相關(guān)文獻(xiàn)23篇，排除重復(fù)報(bào)道病例后，共2個(gè)家系(比利時(shí)和愛(ài)爾蘭)和3例散發(fā)病例(剛果民主共和國(guó)和日本各1例，另1例國(guó)別不詳)，總計(jì)18例，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)(L270P、S272P、I290T、I294T)[1-4,]，2001年歐洲報(bào)道了第1個(gè)XLN家系，2018年日本報(bào)道了第1例亞洲XLN病例[5]。

對(duì)國(guó)外報(bào)道的本文18例及本文患兒(共19例)進(jìn)行了臨床資料總結(jié)和分析(表1)?；颊呔鶠槟行?，Sanger測(cè)序均發(fā)現(xiàn)WAS基因GBD結(jié)構(gòu)域突變，ANC減少占84.2%(16/19)，其中15例<0.5×109·L-1，單核細(xì)胞數(shù)量減少(13/18，72.2%)，WBC數(shù)量降低(9/14，64.3%)。淋巴細(xì)胞亞群分析顯示，NK細(xì)胞數(shù)量均明顯降低(16/16)，CD8+T細(xì)胞升高(7/16，43.7%)、CD4+/CD8+比值倒置(9/16，56.3%)。6例(54.5%)骨髓細(xì)胞學(xué)存在粒系成熟障礙，其中2例伴有染色體核型異常，2例伴紅系/淋巴系發(fā)育異常，余2例僅有粒系成熟障礙。WAS基因功能獲得性突變臨床上主要表現(xiàn)為反復(fù)細(xì)菌感染(11/17, 64.7%),3例頻率可達(dá)每年8～10次，1例表現(xiàn)為不明原因發(fā)熱、2例無(wú)癥狀、3例ANC正常?；颊呋蛲蛔兂Ｓ诔赡旰蟀l(fā)現(xiàn)(10/14, 71.4%)，此前僅2例患者在兒童期即發(fā)現(xiàn)基因異常[5]，但其ANC處于正常水平，不能診斷為XLN。本文患兒是確診年齡最小的XLN患者。

3 討論

WAS基因突變常導(dǎo)致經(jīng)典的Wiskott-Aldrich綜合征(WAS)，以PLT減少伴體積縮小、濕疹及反復(fù)感染為臨床特征，病情常較危重，多因嚴(yán)重感染和出血而死亡[6]。WAS基因突變還可導(dǎo)致臨床表型較輕的X-連鎖血小板減少癥(XLT)和X連鎖中性粒細(xì)胞減少癥(XLN)。相關(guān)疾病不同臨床表型與WAS基因突變類(lèi)型不同有關(guān)，無(wú)義突變和缺失突變導(dǎo)致WAS蛋白(WASP)表達(dá)缺失，引起嚴(yán)重的WAS綜合征；錯(cuò)義突變導(dǎo)致WASP表達(dá)減少，引起XLT或者較輕的WAS綜合征；WAS基因功能獲得性突變則會(huì)引起XLN[7, 8]。XLN較其他兩種疾病表型罕見(jiàn)。

表1 WAS基因功能獲得性突變患者的臨床特征

注 G-CSF：粒細(xì)胞集落刺激因子；MDS：骨髓增生異常綜合征；NA：未檢查；URTI：上呼吸道感染；AML：急性髓細(xì)胞白血??；ANC：中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)；WBC：×109·L-1；N：中性粒細(xì)胞；M：?jiǎn)魏思?xì)胞；L：淋巴細(xì)胞

WASP可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架生成，從而參與多種細(xì)胞生命過(guò)程，如細(xì)胞遷移、黏附聚集、分裂增殖等。WAS蛋白家族包括WASP、N-WASP、Scar/WAVE和Bee1，分別具有不同的組織特異性表達(dá)，其中WASP僅在血液系統(tǒng)表達(dá)。WASP在非激活狀態(tài)下，C端的VCA結(jié)構(gòu)域與GBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，稱(chēng)為WASP的自身抑制。Cdc42是Rho家族成員，具有GTP酶活性，通過(guò)與GBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合激活WASP和N-WASP[9]。當(dāng)VCA與GBD結(jié)合被Cdc42破壞后，WASP游離C端通過(guò)激活A(yù)rp2/3復(fù)合體[10]，進(jìn)而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合[11-13]。目前報(bào)告的XLN病例，其突變位點(diǎn)均位于WASP的GBD結(jié)構(gòu)域，WASP自身抑制平衡被打破，造成Arp2/3復(fù)合體持續(xù)激活，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合異常，細(xì)胞極化異常，細(xì)胞凋亡增加，這在一定程度上解釋了骨髓粒系成熟障礙[1-3, 14]。

XLN患者臨床表現(xiàn)為ANC減少，部分患者有反復(fù)細(xì)菌感染，但與重型先天性中性粒細(xì)胞減少癥(SCN)及經(jīng)典WAS綜合征患者相比，XLN患者感染相對(duì)較輕，導(dǎo)致了臨床上容易漏診及確診年齡較晚[2]。研究報(bào)道，XLN患者唾液的中性粒細(xì)胞數(shù)量正常，XLN小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由WAS功能獲得性突變導(dǎo)致中性粒細(xì)胞過(guò)度激活，并向外周組織遷移增加[15]。這是否可以解釋XLN患者雖然ANC數(shù)量低但感染并不嚴(yán)重的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步研究。

目前報(bào)道中對(duì)XLN患者的治療主要參照SCN治療方案，包括預(yù)防性應(yīng)用抗生素和皮下注射G-CSF。G-CSF是快速升高ANC的最有效方法，可以明顯改善患者預(yù)后和生存質(zhì)量[16]，但是長(zhǎng)期使用存在并發(fā)血液系統(tǒng)惡變的風(fēng)險(xiǎn)，以急性髓細(xì)胞白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)最為常見(jiàn)。國(guó)際重癥慢性中性粒細(xì)胞減少癥登記處(SCNIR)對(duì)長(zhǎng)期大劑量使用G-CSF治療SCN患者隨訪15年后發(fā)現(xiàn)，約22%轉(zhuǎn)化為AML/MDS[17]。SCN患者長(zhǎng)期使用G-CSF可造成CSF3R基因繼發(fā)突變，該基因突變與血液系統(tǒng)惡變高度相關(guān)，在XLN病例中同樣存在該現(xiàn)象[18]。2001年首次報(bào)道XLN家系的課題組[1]對(duì)該家系中5例患者長(zhǎng)期隨訪，于2009年發(fā)現(xiàn)2例患者發(fā)生血液系統(tǒng)惡變[18]，其中1例患者33歲起使用G-CSF 0.3 mg，每周3次，6年后發(fā)生AML，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CSF3R基因g.2425T>G(p.Y729)突變；另1例患者63歲開(kāi)始使用G-CSF 0.3 mg·d-1，持續(xù)皮下注射2年后發(fā)生MDS-RAEB，并發(fā)現(xiàn)CSF3R基因g.2390C>T (p.Q718)突變?cè)斐傻腃SF3R翻譯提前終止。鑒于嬰兒期因粒細(xì)胞減少導(dǎo)致膿毒血癥而夭折的風(fēng)險(xiǎn)較大，而長(zhǎng)期使用G-CSF又有引起CSF3R繼發(fā)突變和導(dǎo)致血液系統(tǒng)惡變的風(fēng)險(xiǎn)，因而有研究者建議預(yù)防性使用抗生素作為基本治療手段，并在綜合考慮風(fēng)險(xiǎn)與收益的基礎(chǔ)上，建議嬰兒期使用G-CSF[3]?？傊?，對(duì)是否使用G-CSF，仍有爭(zhēng)議，目前尚無(wú)對(duì)G-CSF治療無(wú)反應(yīng)或行骨髓移植治療的XLN病例報(bào)道。

本例患兒是國(guó)內(nèi)報(bào)道的第1例因WAS基因功能獲得性突變導(dǎo)致XLN的病例，外周血ANC持續(xù)減少、骨髓粒細(xì)胞成熟障礙是重要的臨床診斷線索，基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WAS基因突變可以明確診斷。與經(jīng)典WAS綜合征引起WASP表達(dá)缺失或低表達(dá)不同，XLN患者的WASP仍可表達(dá)，也是臨床上容易忽視的重要因素。因此，對(duì)臨床上懷疑先天性粒細(xì)胞減少癥的患兒，需警惕WAS基因缺陷。