超聲輔助有機(jī)溶劑回流提取水飛薊籽中水飛薊素工藝的優(yōu)化

張麗芳， 林 霞， 馮星海， 高東香

（九江學(xué)院， 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 江西 九江332000）

水飛薊素為菊科植物水飛薊籽提取所得的天然黃酮類成分， 具有保護(hù)肝細(xì)胞膜、 改善肝功能等藥理活性［1-2］， 臨床上主要用于慢性肝損傷、 慢性肝炎、 肝硬化等輔助治療［3-4］。 近年研究發(fā)現(xiàn)， 水飛薊素在降脂、 降糖、 防治動(dòng)脈粥樣硬化、 免疫調(diào)節(jié)、 抗腫瘤等方面也有顯著效果［5-7］， 其有效成分以“雙賓”， 即水飛薊賓和異水飛薊賓含有量最高， 藥理活性最強(qiáng)［1］。

黃酮類成分的提取工藝包括浸提法［8］、 回流提取法［9］、 超 聲 波 提 取 法［10］、 微 波 提 取 法［11］、 酸 堿 提 取法［12］、 酶解提取法［13］、 超臨界CO2萃取法［14］等， 其中水飛薊素傳統(tǒng)提取工藝大多采取有機(jī)溶劑浸提或回流法， 盡管前者提取效率高， 雜質(zhì)少， 但存在溶劑用量大、 熱敏性組分易破壞、 周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)［9］。 超聲提取是近年來(lái)應(yīng)用于中藥材有效成分提取工藝的一種較成熟的技術(shù)［15］， 其機(jī)理主要是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、 空化效應(yīng)、 攪拌等作用使植物細(xì)胞壁破裂， 加速細(xì)胞內(nèi)有效成分向溶劑溶解擴(kuò)散， 從而提高中藥提取率， 縮短提取時(shí)間， 節(jié)約溶劑， 避免長(zhǎng)時(shí)間高溫對(duì)活性物質(zhì)的降解［16］。

為了將回流提取和超聲提取的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)， 本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察超聲輔助有機(jī)溶劑回流提取對(duì)水飛薊籽中水飛薊素提取率的影響。 此外， 目前水飛薊素得率的測(cè)定主要以粗提物中黃酮含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 并不能真實(shí)反映產(chǎn)物中主要活性成分含有量， 故又建立HPLC 法測(cè)定水飛薊賓、異水飛薊賓含有量， 從而更客觀地評(píng)價(jià)各提取條件的優(yōu)劣。

1 材料

SB25-12DTD 型超聲清洗機(jī)（40 kHz、 600 W， 寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司）； RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； TGL-16B 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； AL204 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； TU-1901 型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）； Varian Prostar 230 高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國(guó)瓦里安公司）。 蘆丁、 水飛薊賓、 異水飛薊賓對(duì)照品（含有量98%， 上海源葉生物科技有限公司）。 水飛薊籽購(gòu)自河北省安國(guó)市瑞琪中藥材有限公司。 甲醇為色譜純（美國(guó)Merck 公司）； 石油醚、 無(wú)水乙醇、 乙腈、 乙酸乙酯、 丙酮、 正己烷、 硝酸鋁、 氫氧化鈉、 三氯化鋁為分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠）。

2 方法

2.1 水飛薊素提取 水飛薊籽冷凍干燥24 h 后粉碎， 過(guò)40 目篩， 粉末置于索氏提取器中， 按1 ∶8 料液比加入正己烷， 脫脂6 h 以上， 揮干溶劑， 得到無(wú)脂藥材粉末。 稱取2 g， 加入不同體積有機(jī)溶劑， 超聲輔助水浴熱回流提取， 濾液減壓蒸餾， 得到黃色浸膏提取物。

2.2 單因素試驗(yàn) 考察了甲醇、 乙醇、 乙腈、 乙酸乙酯、丙酮對(duì)水飛薊籽中總黃酮、 水飛薊素提取率的影響， 測(cè)得各溶劑下總黃酮得率分別為3.47%、 3.07%、 3.01%、2.37%、 2.65%， 即甲醇和乙醇的提取能力較強(qiáng)。 盡管甲醇提取率最高， 但其提取液色澤最深， 并且含有大量不溶性雜質(zhì)， 基于提取效率、 安全性、 經(jīng)濟(jì)性考慮， 最終確定乙醇作為提取溶劑。 因素水平見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平

2.2.1 提取時(shí)間 取脫脂藥材粉末2 g， 加入30 mL 無(wú)水乙醇， 加熱回流至沸騰開始計(jì)時(shí)， 超聲功率300 W， 設(shè)定提取時(shí)間15、 30、 45、 60、 90 min， 測(cè)定總黃酮、 水飛薊素得率。

2.2.2 超聲功率 取脫脂藥材粉末2 g， 加入30 mL 無(wú)水乙醇， 加熱回流至沸騰開始計(jì)時(shí)， 提取時(shí)間60 min， 設(shè)定超聲功率240、 300、 360、 480、 600 W， 測(cè)定總黃酮、 水飛薊素得率。

2.2.3 料液比 取脫脂藥材粉末2 g， 加入無(wú)水乙醇， 加熱回流至沸騰開始計(jì)時(shí)， 提取時(shí)間60 min， 超聲功率300 W， 設(shè)定料液比1 ∶9、 1 ∶12、 1 ∶15、 1 ∶20、 1 ∶25，測(cè)定總黃酮、 水飛薊素得率。

2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上， 選擇乙醇作為提取溶劑， 總黃酮、 水飛薊素得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 提取時(shí)間（A）、 超聲功率（B）、 料液比（C） 作為影響因素， 進(jìn)行L9（33） 正交試驗(yàn)。 因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平

2.4 提取方法比較 精密稱取脫脂藥材粉末2 g， 分別采取回流法、 超聲法、 超聲輔助回流法進(jìn)行提取。 其中， 回流條件為無(wú)水乙醇30 mL， 回流60 min， 超聲條件為無(wú)水乙醇30 mL， 提取時(shí)間60 min， 超聲功率360 W； 超聲輔助回流條件為無(wú)水乙醇30 mL， 加熱回流至沸騰開始計(jì)時(shí)，提取時(shí)間60 min， 超聲功率360 W， 各條件平行提取3 份，測(cè)定總黃酮、 水飛薊素得率。

2.5 總黃酮得率測(cè)定 以蘆丁為對(duì)照品， 通過(guò)NaNO2-Al （NO3）3-NaOH 比色法測(cè)定總黃酮含有量。 水飛薊素提取物加入甲醇溶解， 定容于10 mL 量瓶中， 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 取0.2 mL 續(xù)濾液于50 mL 量瓶中， 加入5%NaNO2溶 液1 mL， 搖 勻 后 靜 置6 min， 再 加 入10% Al（NO3）3溶液1 mL， 搖勻后靜置6 min， 再加入10%NaOH 溶液10 mL， 70% 乙醇定容至刻度， 混勻， 靜置15 min， 于504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度， 計(jì)算總黃酮得率， 公式為得率＝［（總黃酮質(zhì)量濃度×體積×稀釋倍數(shù)） ／藥材質(zhì)量］ ×100%。

2.6 水飛薊素得率測(cè)定 采用HPLC 法， 條件為Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm）； 流動(dòng)相冰醋酸（pH＝3） -甲醇（50 ∶50）； 檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm； 柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。 精密稱取藥材提取物20 mg， 流動(dòng)相溶解定容于10 mL 量瓶中， 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 取0.5 mL 續(xù)濾液置于10 mL 量瓶中， 流動(dòng)相定容， 混勻， 作為供試品溶液。 采用峰面積歸一化法， 參考對(duì)照品出峰時(shí)間和峰面積， 計(jì)算水飛薊素得率， 公式為得率＝｛［（水飛薊賓質(zhì)量濃度＋異水飛薊賓質(zhì)量濃度） ×體積×稀釋倍數(shù)× （浸膏質(zhì)量／20 mg） ］ ／藥材質(zhì)量｝ ×100%。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 吸光度為縱坐標(biāo)（A） 回歸， 得蘆丁方程為A ＝0.011 2X-0.032 6（R2＝0.999 9）， 在8.00～56.00 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 回歸， 得水飛薊賓、 異水飛薊賓方程分別為Y ＝17.441X ＋346.63（R2＝0.999 2）、 Y＝21.345X＋178.56（R2＝0.999 1），分別在2.00～100.00、 0.80～60.00 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 提取時(shí)間 圖2 顯示， 隨著提取時(shí)間增加， 總黃酮、 水飛薊素得率不斷增加， 在60 min 時(shí)最高； 繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間， 兩者得率反而下降， 表明提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將使部分成分發(fā)生分解。 因此， 提取時(shí)間選擇45～90 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮、 水飛薊素得率的影響

3.2.2 超聲功率 圖3 顯示， 超聲功率300 W 時(shí)總黃酮得率最高， 表明細(xì)胞壁破碎相對(duì)較完全， 乙醇大量滲入細(xì)胞內(nèi)部， 成分得到充分溶解， 并經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)外滲透壓驅(qū)使隨溶劑轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外， 但隨著超聲功率進(jìn)一步增加其得率逐漸下降， 表明正被進(jìn)一步降解； 水飛薊素得率變化較總黃酮平緩， 在360 W 最高， 之后逐漸下降。 因此， 超聲功率選擇240～360 W。

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮、 水飛薊素得率的影響

3.2.3 料液比 圖4 顯示， 隨著料液比增加， 總黃酮、 水飛薊素得率均有所增加； 當(dāng)料液比超過(guò)1 ∶20 時(shí)， 前者得率保持穩(wěn)定； 當(dāng)料液比超過(guò)1 ∶15 時(shí)， 后者得率無(wú)明顯變化。 綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本和成分得率， 料液比選擇1 ∶15～1 ∶25。

圖4 料液比對(duì)總黃酮、 水飛薊素得率的影響

3.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上， 按照表2 因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)， 結(jié)果見表3， 方差分析見表4。 由表可知，各因素影響程度依次為提取時(shí)間（A） ＞超聲功率（B） ＞料液比 （C）； 總黃酮、 水飛薊素最優(yōu)水平組合分別為A2B2C3、 A2B3C1， 兩者方差分析結(jié)果基本吻合： 因素A 影響顯著（P＜0.05）， 故選擇水平2， 而B、 C 影響不顯著（P＞0.05）， 選擇任一水平均可， 綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本和水飛薊素得率， B 選擇3 水平， C 選擇1 水平為宜。 綜上所述，最優(yōu)工藝為A2B3C1， 即提取時(shí)間60 min， 超聲功率360 W，料液比1 ∶15。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取脫脂藥材粉末2 g， 加入30 mL無(wú)水乙醇， 加熱回流至沸騰開始計(jì)時(shí)， 提取時(shí)間60 min，超聲功率360 W， 平行3 份， 測(cè)得總黃酮、 水飛薊素平均得率分別為3.60% （RSD ＝0.05%）、 1.64% （RSD ＝0.13%）， 表明工藝穩(wěn)定可行， 重復(fù)性好。

3.5 提取方法比較 結(jié)果見表5， 可知超聲輔助有機(jī)溶劑回流提取法提取效果優(yōu)于乙醇熱回流提取法和超聲提取法。

表5 3 種提取方法比較

4 討論

國(guó)內(nèi)水飛薊素生產(chǎn)基本上是原料直接加工， 對(duì)水飛薊種皮分離性能要求高， 殼渣中的蛋白、 殘留脂肪將浪費(fèi)大量溶劑， 提取物雜質(zhì)多， 不利于精制， 故改進(jìn)提取工藝對(duì)相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量意義重大。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助有機(jī)溶劑回流提取水飛薊籽中水飛薊素工藝， 發(fā)現(xiàn)在提取時(shí)間60 min、 超聲功率360 W、料液比1 ∶15 條件下， 總黃酮、 水飛薊素得率最高， 分別達(dá)3.60%、 1.64%， 與常規(guī)乙醇熱回流提取法、 超聲提取法比較， 該方法可明顯提高有效成分得率， 同時(shí)能縮短浸提時(shí)間， 降低溶劑用量， 為制藥工業(yè)中水飛薊素及水飛薊賓提取工藝的改進(jìn)提供參考依據(jù)。