補(bǔ)骨脂酒制工藝的優(yōu)化

葉斌斌， 敖楠楠， 姜明月， 曲 揚(yáng)， 鄭 彧

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 遼寧 大連116600）

補(bǔ)骨脂別名和蘭莧、 胡韭子， 為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果實(shí)， 其性溫、 味辛， 具有補(bǔ)腎助陽、 溫中止瀉、 納氣平喘之功效［1］。 但補(bǔ)骨脂溫燥之性易傷陰助火， 故臨床用藥需對(duì)其進(jìn)行炮制， 炮制方法始載于《雷公炮炙論》， 有雷公法、 酒浸炒、 清炒、 鹽炙、蒸法等［2］， 目前其炮制工藝以2015 版《中國藥典》 中所規(guī)定的鹽炙法為主， 關(guān)于炮制前后成分種類及含有量變化的研究也大多為鹽炙品［3-4］。

然而， 研究表明補(bǔ)骨脂經(jīng)鹽炙后香豆素、 黃酮、 單萜酚類成分均呈上升趨勢(shì)［5］， 而補(bǔ)骨脂酚具有肝毒性和腎毒性［6-7］， 可能會(huì)對(duì)臨床用藥的安全性產(chǎn)生影響。 補(bǔ)骨脂酒制品古來有之， 但雷公制因其操作繁復(fù)性不利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)， 課題組前期考察酒制法與雷公制所得指紋圖譜［8］， 發(fā)現(xiàn)兩者有效成分種類及含有量差異較小， 本實(shí)驗(yàn)通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化補(bǔ)骨脂酒制工藝， 以期完善該工藝， 并為后續(xù)相關(guān)炮制機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 9030A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； LC-10AT 高效液相色譜儀 （日本島津公司）； DFT-50 手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）； KQ2200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； AE240 電子分析天平（十萬分之一， 瑞士Mettler-Toledo 公司）； HC-2518R 高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 補(bǔ)骨脂（產(chǎn)地安徽， 批號(hào)20160859） 及補(bǔ)骨脂素（批號(hào)140706）、 異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)150422）、 補(bǔ)骨脂甲素（批號(hào)140904）、 補(bǔ)骨脂乙素（批號(hào)140515）、 補(bǔ)骨脂寧（批號(hào)150804）、 補(bǔ)骨脂定（批號(hào)140716）、 補(bǔ)骨脂酚（批號(hào) wkq16061501）、 補(bǔ) 骨 脂 二 氫 黃 酮 甲 醚 （批 號(hào)150305） 對(duì)照品均由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供，含有量均≥98%。 乙腈、 甲醇為色譜純， 由美國Thermo Fisher Scientific 公司提供； 水為超純水， 由杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司提供； 龍泉黃酒 （產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)GB／T 13662-2008） 由大連長興島酒業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 成分含有量測(cè)定（HPLC 法）

2.1.1 色譜條件 J＆K Chemical Ltd 色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm， S／N SJA702-05）； 流動(dòng)相乙腈-水， 梯度洗脫（0～10 min， 5% ～45%乙腈； 10～45 min， 45% ～70%乙腈； 45～60 min， 70% ～100% 乙腈； 60 ～70 min， 100% 乙腈）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長220、250 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量， 甲醇配制成一定質(zhì)量濃度貯備液， 精密吸取適量置于10 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 即得含補(bǔ)骨脂素0.18 mg／mL、 異補(bǔ)骨脂素0.09 mg／mL、 補(bǔ)骨脂甲素0.12 mg／mL、 補(bǔ)骨脂乙素0.222 mg／mL、 補(bǔ) 骨 脂 寧0.036 mg／mL、 補(bǔ) 骨 脂 定0.128 mg／mL、 補(bǔ)骨脂酚1.051 mg／mL.、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚0.154 mg／mL 的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末（過3 號(hào)篩） 約0.2 g， 置于25 mL 量瓶中， 70%乙醇超聲1 h， 放冷， 定容至刻度， 搖勻后靜置， 上清液離心， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液， 稀釋0、 1.25、 5／3、 2.5、 5、 10 倍， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見表1， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液， 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得各成分峰面積RSD 為0.92% ～1.65%， 表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材6 份， 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得各成分峰面積RSD 為1.83% ～2.36%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液， 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得各成分峰面積RSD 為1.57% ～2.19%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定含有量已知的藥材粉末6 份， 每份約0.1 g， 精密加入各對(duì)照品， 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得各成分平均加樣回收率為97.23% ～101.52%， RSD 為0.99% ～2.06%。

2.3 酒制工藝優(yōu)化 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上， 選擇烘制溫度（A）、 加熱時(shí)間（B）、 黃酒量（C） 作為影響因素， 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)確定三因素三水平， 因素水平見表2。 再稱取17 份藥材， 每份10 g， 以補(bǔ)骨脂素（W1）、 異補(bǔ)骨脂素（W2）、 補(bǔ)骨脂甲素（W3）、 補(bǔ)骨脂乙素（W4）、 補(bǔ)骨脂寧（W5）、 補(bǔ)骨脂定（W6）、 補(bǔ)骨脂酚（W7）、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（W8） 含有量為影響因素， 采用加權(quán)評(píng)分法優(yōu)化酒制工藝［9］（設(shè)定滿分為100 分， 由于補(bǔ)骨脂素、 異補(bǔ)骨脂素為主要有效成分［10］， 故其權(quán)重系數(shù)均設(shè)定為0.2，而其他6 種成分均設(shè)定為0.1）， 計(jì)算綜合評(píng)分 （Y，0.2 W1／W1max×100 ＋0.2W2／W2max×100 ＋0.1W3／W3max×100 ＋0.1W4／W4max×100 ＋0.1W5／W5max×100 ＋0.1W6／W6max×100 ＋0.1W7／W7max×100＋0.1W8／W8max×100）， 結(jié)果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過Design Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到 方程為Y ＝86.44 ＋0.98A-0.85B-0.62C ＋0.48AB-1.27AC-0.07BC-1.25A2-1.63B2-2.33C2（R2＝0.914 6），方差分析見表4。 由表可知， 模型P＜0.05， 可用于預(yù)測(cè)；因素A （烘制溫度）、 B （加熱時(shí)間） 對(duì)綜合評(píng)分影響顯著（P＜0.05）， 而C 影響不顯著（P＞0.05）。 響應(yīng)面分析見圖1。

表4 方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)回歸方程， 確定最佳酒制工藝為每100 g 補(bǔ)骨脂中加入17.36 g 黃酒， 169.25 ℃下加熱烘制9.08 min， 為了便于工業(yè)化操作， 將其修正為每100 g 補(bǔ)骨脂中加入17 g 黃酒， 169 ℃下加熱烘制9 min。 然后， 取3份藥材， 每份100 g， 按照上述優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)， 測(cè)得補(bǔ)骨脂素、 異補(bǔ)骨脂素、 補(bǔ)骨脂甲素、 補(bǔ)骨脂乙素、 補(bǔ)骨脂寧、 補(bǔ)骨脂定、 補(bǔ)骨脂酚、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚含有量分別為0.381%、 0.395%、 0.470%、 0.877%、 0.344%、0.626%、 8.041%、 0.915%， 綜合評(píng)分86.21， 與預(yù)測(cè)值86.84 相當(dāng)， 表明該工藝穩(wěn)定可行。

圖1 各因素響應(yīng)面圖

3 討論

目前， 補(bǔ)骨脂炮制工藝考察經(jīng)常僅以補(bǔ)骨脂素、 異補(bǔ)骨脂素含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)［11］， 而本實(shí)驗(yàn)選擇補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、 補(bǔ)骨脂甲素、 補(bǔ)骨脂乙素、 補(bǔ)骨脂定、 補(bǔ)骨脂寧、 補(bǔ)骨脂酚、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚含有量的綜合評(píng)分，可避免單一成分的片面性， 為相關(guān)生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供參考。 同時(shí)， 還采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)［12］優(yōu)化酒制工藝， 該方法選擇實(shí)驗(yàn)體系的目標(biāo)響應(yīng)值作為單個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的函數(shù)， 并在整個(gè)區(qū)域上找到考察因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)表達(dá)式， 與正交設(shè)計(jì)、 均勻設(shè)計(jì)比較更接近客觀實(shí)際，而且兼顧了多個(gè)影響因素及因素之間的相互作用， 使試驗(yàn)次數(shù)較少的同時(shí)獲得更精確的參數(shù)。

補(bǔ)骨脂生品中， 補(bǔ)骨脂素、 異補(bǔ)骨脂素、 補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、 補(bǔ)骨脂寧、 補(bǔ)骨脂定、 補(bǔ)骨脂酚、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚含有量分別為0.403%、 0.410%、 0.499%、0.882%、 0.312%、 0.546%、 8.759%、 0.851%， 而經(jīng)優(yōu)化工藝所得酒制品中補(bǔ)骨脂素、 異補(bǔ)骨脂素含有量略微下降，可能是由于酒制過程中的高溫使香豆素類成分開環(huán)所致；補(bǔ)骨脂酚含有量呈下降趨勢(shì)， 可能是由于該成分屬于單萜酚類化合物， 具有揮發(fā)性， 在加熱過程中隨水蒸氣一同蒸發(fā)所致， 并且它具有肝毒性和腎毒性［6-7］， 其含有量下降表明酒制可能具有減毒功效； 黃酮類成分含有量呈上升趨勢(shì)，前期研究表明該現(xiàn)象可能是補(bǔ)骨脂在炮制過程中種皮破碎，從而引起藥材溶出率增大［13］， 但本實(shí)驗(yàn)在制備供試品時(shí)以藥材細(xì)粉為原料， 避免了因藥材組織結(jié)構(gòu)松散而引起含有量變化的干擾， 故其含有量變化可能是藥材中各成分之間發(fā)生轉(zhuǎn)化， 具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

今后， 本實(shí)驗(yàn)將考察補(bǔ)骨脂生品及不同炮制品對(duì)腺嘌呤致腎陽虛小鼠的治療作用， 用于明確藥材炮制前后的藥效學(xué)變化， 為其量效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。