西紅花HPLC 指紋圖譜建立及成分分析

邢越陽(yáng)， 高 崎， 張 雪， 司睿蓉， 吳佩穎，?

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海201203； 2. 上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司， 上海201203； 3. 上海市藥材有限公司， 上海200002）

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭， 有活血化瘀、 涼血解毒、 解郁安神之功效， 《本草綱目》［1］對(duì)其功效表述為“心憂郁積，氣悶不散， 活血。 久服令人心喜。 又治驚悸”， 西紅花苷是西紅花主要活性成分， 在抗腫瘤、 治療心腦血管疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有一定療效?，F(xiàn)代藥理研究表明， 西紅花具有降血脂、 調(diào)節(jié)膽固醇［2-4］、 抗炎［5-6］、 抗氧化［7-8］、 改善記憶［9-10］、 抗腫瘤［11］等作用。

西紅花在食品、 醫(yī)藥、 美容等領(lǐng)域有重大應(yīng)用價(jià)值， 但其需求量巨大， 無(wú)法完全滿足市場(chǎng)需求。目前， 2015 版《中國(guó)藥典》 僅規(guī)定西紅花苷-I 和西紅花苷-II 總含有量不低于10.0%， 但中藥成分復(fù)雜， 單靠1、 2 種成分含有量來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量并不全面。 曾水云等［12］通過(guò)建立HPLC 指紋圖譜對(duì)不同產(chǎn)地西紅花進(jìn)行比較， 共標(biāo)定12 個(gè)共有峰， 通過(guò)分析各峰面積相對(duì)比值的差異來(lái)區(qū)別其來(lái)源； 本實(shí)驗(yàn)采用該方法， 以期對(duì)該藥材進(jìn)行更全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity ARC UHPLC 高效液相色譜儀、 Waters ACQUITY UPLCTMI-CLASS 超高效液相色譜儀、 Waters XevoG2-XS Q-TOF·ESI 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)沃特世公司）； KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius Quintx65-1CN 分析天平［十萬(wàn)分之一， 賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］。

1.2 試藥 甲酸（分析純， 批號(hào)20141223， 上海豪申化學(xué)試劑有限公司）； 甲醇（色譜純， 批號(hào)175159， 德國(guó)Merck 公司）； 乙腈（色譜純， 批號(hào)175157， 德國(guó)Merck 公司）； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司， 批號(hào)201801053210BL06683）。西 紅 花 苷-Ⅰ （ 批 號(hào) 111588-201303， 含 有 量92.6%）、 西紅花苷-Ⅱ（批號(hào)111589-201304， 含有量92.4%） 對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

建立對(duì)照指紋圖譜所需西紅花由上海市藥材有限公司西紅花事業(yè)部提供； 市售樣品經(jīng)網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物平臺(tái)按銷量排序， 選購(gòu)排名前二十者， 經(jīng)上海市藥材有限公司裴衛(wèi)忠藥師鑒定為正品。 具體見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 （4.6 mm × 100 mm， 2.7 μm）； 流 動(dòng) 相［0.2%乙酸-乙腈（87 ∶13） ］ （A） -甲醇（B），梯度洗脫 （0 ～12 min， 0 ～35% B； 12 ～18 min，35% ～50% B； 18 ～26 min， 50% ～100% B； 26 ～28 min， 100%B）； 體積流量1.0 mL／min； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量10 μL。

UPLC 液相方法同上， 洗脫梯度調(diào)整為0 ～30 min， 0～35%B； 30～45 min， 35% ～50%B； 45 ～65 min， 50% ～100%B； 65～70 min， 100%B， 進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正離子檢測(cè)模式； 毛細(xì)管電壓3.0 kV； 錐孔電壓30 V；離子源溫度120 ℃； 去溶劑化溫度500 ℃； 去溶劑化氣體積流量800 L／h； 錐孔氣體積流量50 L／h；碰撞氣氬氣； 低碰撞能量通道5 eV； 高碰撞能量通道20 eV。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末50.0 mg， 置棕色樣品瓶中， 精密加入50.0 mL 稀乙醇， 稱定質(zhì)量， 冰水浴超聲（200 W、 40 kHz）30 min， 取出， 放置室溫， 溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻， 過(guò)0.22 μm 微孔濾膜， 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一藥材粉末5 份， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于2.87%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取藥材粉末， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次， 測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD均小于2.72%， 表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材粉末， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、 2、 4、 8、 12 h 進(jìn)樣， 測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2.85%， 表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立 取“1.2” 項(xiàng)下10 批樣品， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 色譜圖見(jiàn)圖1。 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2012.130723 版進(jìn)行分析， 在生成對(duì)照狀態(tài)下通過(guò)多點(diǎn)校正， 時(shí)間窗0.1 min， 平均數(shù)模式， 全譜峰匹配， 生成對(duì)照?qǐng)D譜。 西紅花苷-I 作為西紅花中主要成分， 易于得到對(duì)照品， 含有量較高， 在指紋圖譜中的分離度良好， 因此選擇其作為參比峰， 共標(biāo)定20 個(gè)共有峰，計(jì)算10 批藥材共有峰與參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積， 結(jié)果見(jiàn)表2～3。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 10 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks of ten batches of samples

表3 10 批樣品共有峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of ten batches of samples

2.5 相似度評(píng)價(jià) 20 種藥材按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣， 將結(jié)果與對(duì)照指紋圖譜比對(duì)， 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.130723 版系統(tǒng)評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度。結(jié)果， S1 ～S10 的相似度分別為0.997、 0.998、 0.998、 0.999、 0.996、 0.956、0.995、 0.999、 0.990、 0.988， A～T 的相似度分別 為 0.998、 0.998、 0.993、 0.996、 0.996、0.999、 0.998、 0.996、 0.998、 0.998、 0.995、0.997、 0.999、 0.995、 0.998、 0.995、 0.993、0.999、 0.996、 0.995， 均在0.9 以上， 表明藥材中各成分整體比例相近， 相似度較高， 差異較小。

2.6 成分標(biāo)定 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣， 得色譜圖和正、 負(fù)離子模式下的總離子流圖， 分別記錄各色譜峰在HPLC、 UPLC 條件下的出峰時(shí)間， 以及以峰14 為參照的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2～3。

2.7 質(zhì)譜分析 根據(jù)正離子模式下各色譜峰的母離子及二級(jí)碎片信息， 通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)了HPLC 指紋圖譜中的10 個(gè)主要色譜峰。

西紅花苷是一類由西紅花酸與不同數(shù)量葡萄糖形成的酯類化合物， 而糖苷鍵不穩(wěn)定， 易發(fā)生斷裂。 通 過(guò) 總 結(jié) 分 析 Carmona［13］、 Verma［14］、Lech［15］等對(duì)西紅花的研究， 發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜信號(hào)中常會(huì)出現(xiàn)西紅花酸與Na＋或H＋結(jié)合的分子離子峰m／z351.2 或329.2， 或不同數(shù)量葡萄糖基團(tuán)與西紅花酸結(jié)合的質(zhì)譜碎片， 如m／z 513.2 為與單糖結(jié)合的分子離子峰、 m／z 675.2 為與雙糖結(jié)合的分子離子峰等， 由此推斷峰2～10 為西紅花苷類成分， 其中峰19、 20 在330 nm 波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收， 推測(cè)其可能為質(zhì)譜圖順式結(jié)構(gòu)。

表4 色譜峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.4 Relative retention time of chromatographic peaks

峰14、 19 質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4 ～5， 其準(zhǔn)分子離子峰m／z 999.36， 為西紅花酸結(jié)合4 分子葡萄糖的西紅花苷類成分， 峰14 正離子模式下碎片離子峰m／z有511.180 8 ［M ＋2Na］2＋， 675.264 0 ［M-Gnt ＋Na］＋， 837.315 7 ［M-Glc ＋Na］＋， 329.174 9 ［M-2?Gnt ＋H］＋， 351.158 2 ［M-2 ?Gnt ＋Na］＋，347.094 8 ［Gnt＋Na］＋， 311.164 0 ［M-2?Gnt＋HH2O］＋； 峰19 在正離子模式下碎片離子峰m／z 與其類似， 兩者質(zhì)譜裂解規(guī)律也大致相同。 結(jié)合碎片離子峰， 推斷峰14 為西紅花苷-I （C44H64O24）， 根據(jù)對(duì)照品證實(shí)西紅花苷-I； 峰19 的保留時(shí)間較峰14 晚， 同時(shí)在330 nm 波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收， 根據(jù)文獻(xiàn)推斷為西紅花苷-I 的順式結(jié)構(gòu)cis-4-GG。

圖2 樣品UPLC-UV 色譜圖Fig.2 UPLC-UV chromatogram of samples

圖3 樣品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of samples

圖4 峰14 化合物質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of peak 14 compounds

圖5 峰19 化合物質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of peak 19 compounds

圖5 表明， 該化合物在254 nm 波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收， 結(jié)合其保留時(shí)間及文獻(xiàn)推斷為西紅花苦苷（C16H26O7）， m／z 353.156 8 ［M＋Na］＋是其母離子與一分子Na＋結(jié)合的分子離子峰， 質(zhì)譜碎片m／z 151.110 4 推斷為母離子脫掉葡萄糖基團(tuán)的分子離子峰。 西紅花苷類成分裂解規(guī)律大致相同， 西紅花酸結(jié)合不同數(shù)目糖基團(tuán)所形成苷類成分的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子峰信息見(jiàn)表5。

表5 各成分LC-MS 分析Tab.5 LC-MS analysis of various constituents

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定、 可靠、 重復(fù)性好的西紅花HPLC 指紋圖譜， 選取指標(biāo)性成分作為特征峰， 并通過(guò)計(jì)算其與參比峰之間的比例關(guān)系為藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)， 比以某一種或幾種成分含有量作為鑒別標(biāo)準(zhǔn)全面得多。

指紋圖譜共有模式為根據(jù)不同檢測(cè)目的， 通過(guò)軟件擬合不同批次樣品得到的對(duì)照?qǐng)D譜。 本實(shí)驗(yàn)收集了不同年份和產(chǎn)地的西紅花， 用所建立的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)， 適用于大部分樣品， 還可根據(jù)不同檢測(cè)目的生成特定年份或產(chǎn)地的指紋圖譜。

應(yīng)用LC-MS 法對(duì)西紅花中特征性成分的離子碎片信息進(jìn)行采集分析， 結(jié)合文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)分析， 指認(rèn)了其指紋圖譜中10 種成分。 西紅花中主要成分的對(duì)照品較難獲得， 通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)所得化合物的碎片離子峰推測(cè)共有峰成分， 明確各成分比例關(guān)系，比僅標(biāo)定若干共有峰的指紋圖譜更能全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。 本實(shí)驗(yàn)指認(rèn)的10 種成分中西紅花苷-I 和西紅花苷-II 區(qū)分了其順式及反式結(jié)構(gòu)， 目前對(duì)西紅花苷的藥理研究主要集中在其反式結(jié)構(gòu)上［16-18］，而一般認(rèn)為化合物反式結(jié)構(gòu)的活性較順式結(jié)構(gòu)強(qiáng)，因此可通過(guò)比較不同西紅花中順、 反式西紅花苷-I和西紅花苷-II 的含有量加以區(qū)別。 同時(shí)， 2 種成分也是梔子主要化合物， 部分西紅花摻偽就是添加兩者所致， 而應(yīng)用指紋圖譜對(duì)西紅花進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)， 可通過(guò)分析不同成分間的比例關(guān)系來(lái)發(fā)現(xiàn)這種行為。

對(duì)成分的簡(jiǎn)單指認(rèn)并不是指紋圖譜建立的最終目的， 仍需進(jìn)行相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)， 明確具體藥效成分， 在化學(xué)成分與藥理活性之間建立更明確的關(guān)系， 通過(guò)指紋圖譜直觀了解某種藥物的品質(zhì)。