基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及ADME 預(yù)測分析血脂靈片治療血脂異常的Q-marker

郭 銳， 蘇 瑾， 李志雄， 張懂懂， 國大亮?， 肖學(xué)鳳?

（1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 天津300193； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所， 北京100700）

血脂異常也稱為高脂血癥或脂代謝紊亂， 通常指血清中膽固醇、 甘油三酯、 低密度脂蛋白膽固醇過高， 高密度脂蛋白膽固醇過低， 是引起心腦血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一［1-4］， 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、 生活水平不斷提高， 人們患血脂異常的風(fēng)險(xiǎn)也在不斷增加［5］。 目前， 治療血脂異常的藥物以西藥為主， 如他汀類、 貝特類、 煙酸類， 雖然作用較強(qiáng)， 但服用后可能會(huì)出現(xiàn)肝損傷、 橫紋肌溶解、 皮膚過敏、 消化系統(tǒng)、 泌尿系統(tǒng)疾病等不良反應(yīng)［6-7］。 血脂靈片被2015 年版《中國藥典》 收載，治療血脂異常療效確切， 而且經(jīng)臨床驗(yàn)證未見不良反應(yīng)［8］， 它由制何首烏、 決明子、 澤瀉、 山楂4 味藥材組成， 具有化濁降脂、 潤腸通便功效， 用于痰濁阻滯型血脂異常［9-10］， 該方藥味雖少， 但組方精巧， 可降低甘油三酯和膽固醇， 上升低密度脂蛋白膽固醇， 具有很好的降脂作用［8］。

血脂靈片對血脂異常的調(diào)節(jié)作用是由方中多種有效成分通過不同機(jī)制發(fā)揮藥效所致， 但鮮有對其具體物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究， 2015 年版《中國藥典》 只將2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯-2-Oβ-D-葡萄糖苷、 大黃素作為其含有量測定的指標(biāo)，但中藥復(fù)方臨床療效并不是一種或幾種成分作用的結(jié)果， 故藥典方法不足以從整體上控制該制劑質(zhì)量。 因此， 本研究以劉昌孝院士提出的 “Qmarker” 概念為指導(dǎo)［11］， 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和ADME 預(yù)測， 篩選出血脂靈片治療血脂異常的Q-marker。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 化學(xué)成分來源 登錄整合藥理學(xué)平臺（TCM-IP， www.tcmip.cn）， 它是以中藥方劑數(shù)據(jù)庫、 中藥材數(shù)據(jù)庫、 中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、 疾病癥狀靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫為支撐， 模型構(gòu)建和生物信息技術(shù)為手段， 能有效揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)版計(jì)算平臺［12］。 在整合藥理學(xué)平臺“信息設(shè)定” 模塊， 檢索中藥材“何首烏” “澤瀉” “山楂” “決明子”， 選擇檢索出的所有的化學(xué)成分，建立“血脂靈片” 化學(xué)成分庫。

1.1.2 藥物候選靶標(biāo)來源 在整合藥理學(xué)平臺“中藥靶標(biāo)預(yù)測” 模塊， 對所建立的“血脂靈片”化學(xué)成分庫中成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測， 選取血脂靈化學(xué)成分與DrugBank 藥物相似性分?jǐn)?shù)大于0.6 的相似藥物， 取其對應(yīng)靶標(biāo)作為藥物候選靶標(biāo)。

1.1.3 疾病候選靶標(biāo)來源 整合藥理學(xué)平臺以Drugbank 數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)， 藥物信息包括DrugID、Description、 Indication 等字段， 以英文詞為檢索詞， 從Drugbank 數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)FDA 認(rèn)證藥物，然后通過藥物對應(yīng)的靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)疾病靶標(biāo)檢索。 在整合藥理學(xué)平臺的信息設(shè)定界面靶標(biāo)檢索頁面， 選擇“Dyslipidemia” “Hyperlipidemia” 作為血脂異常疾病的關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索， 將檢索出的所有靶標(biāo)作為疾病候選靶標(biāo)。 同時(shí)在“HPO（human phenotype ontology）”（http： ／ ／human-phenotype-ontology.github.io）檢索“Dyslipidemia”， 將“Uniprot” （http： ／ ／www. uniprot. org） 上對應(yīng)有人類基因組的基因添加為自定義靶標(biāo)， 也作為疾病候選靶標(biāo)。

1.1.4 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并分析 應(yīng)用整合藥理學(xué)平臺“網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析” 模塊， 構(gòu)建“血脂靈片” 藥物靶標(biāo)-血脂異常疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)， 篩選出血脂靈復(fù)方中治療血脂異常相關(guān)的成分， 并對這些成分所作用的相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行功能分析及通路分析。

1.2 ADME 預(yù)測 將血脂靈片中經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析出 的 藥 效 成 分 通 過 “Chemspider” （http： ／ ／www.chemspider.com） 進(jìn)行檢索， 并下載對應(yīng)結(jié)構(gòu)式， 導(dǎo)入“ACD／Percepta 軟件” （ACD／Labs， Toronto， Canada）， 應(yīng)用“the passive intestinal permeability of Caco-2 module” “the PK explorer module”模塊預(yù)測透膜吸收和口服生物利用度， 篩選出Papp值大于7.0×10-6cm／s、 F 值大于66%的成分， 作為血脂靈片Q-marker。

2 結(jié)果

2.1 “血脂靈片” 治療血脂異常的核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析 在整合藥理學(xué)平臺“信息設(shè)定” 模塊中檢索中藥材， 其中何首烏共收集到19 種成分， 主要為蒽醌類， 如大黃素甲醚、 大黃酚、 大黃素等， 以及二苯乙烯苷類及其葡萄糖苷類， 如2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、 2， 3， 5， 4′-四羥基-二苯乙烯-2， 3-二-O-β-D-葡萄糖苷等； 澤瀉共收集到31 種成分， 主要為三萜類， 如澤瀉醇A、 澤瀉醇B 等， 以及倍半萜類， 如澤瀉萜醇E、澤瀉萜醇F 等； 決明子共收集到27 種成分， 主要為蒽醌類， 如大黃酸、 蘆薈大黃素、 大黃酚、 大黃素， 以及萘并-吡喃酮類， 如紅鐮霉素、 決明子苷；山楂共收集到30 種成分， 主要為黃酮及其苷類，如洋芹素、 木犀草素等， 黃酮醇及苷類， 如槲皮素、 山柰酚、 草質(zhì)素等， 黃烷及其聚合物類， 如兒茶素、 表兒茶素等， 三萜類， 如熊果酸、 山楂酸，以及酚酸類和其他酸類， 如安息香酸、 沒食子酸、原兒茶酸、 綠原酸等。

在整合藥理學(xué)平臺“中藥靶標(biāo)預(yù)測” 模塊中，將收集到的107 種成分與FDA 批準(zhǔn)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性評分， 將相似性分?jǐn)?shù)大于0.6 的已知藥物對應(yīng)靶標(biāo)定義為藥物靶標(biāo)， 結(jié)果共預(yù)測出8 662個(gè)靶標(biāo)。 在整合藥理學(xué)平臺中， 搜索“Dyslipidemia” “Hyperlipidemia” 得到8 個(gè)疾病靶標(biāo)，又通過HPO 與Uniprot 數(shù)據(jù)庫自定義添加171 個(gè)疾病靶標(biāo)， 共收集到179 個(gè)。

在整合藥理學(xué)平臺“網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析” 模塊中， 基于PPI 數(shù)據(jù)庫中靶標(biāo)的相互作用， 構(gòu)建血脂靈片藥物靶標(biāo)與血脂異常疾病靶標(biāo)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。 首先計(jì)算Degree 拓?fù)涮卣髦担?取大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)作為“hub” 節(jié)點(diǎn)， 然后根據(jù)節(jié)點(diǎn)間的PPI信息建立網(wǎng)絡(luò)。 再分別計(jì)算得到Degree、 Betweenness、 Closeness、 Coreness 拓?fù)涮卣髦担?取四者均大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵靶標(biāo)， 共篩選出408個(gè)。 然后， 提取Degree 拓?fù)涮卣髦蹬琶?00 的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)（圖1）， 其中藥物靶標(biāo)60 個(gè)， 疾病靶標(biāo)15 個(gè)， 其他靶標(biāo)28 個(gè)， 藥物和疾病共同靶標(biāo)3個(gè)， 而且Degree 拓?fù)涮卣髦档拇笮∨c圖中節(jié)點(diǎn)的面積大小呈正相關(guān)關(guān)系。

圖1 血脂靈片靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Targeted network of Xuezhiling Tablets

圖1 中3 個(gè)共同靶標(biāo)是血脂靈片對血脂異常直接干預(yù)的靶標(biāo)， 分別為CPT1A、 CPT2、 AR， 其中CPT1A 是線粒體脂肪酸氧化過程中起到關(guān)鍵作用的酶［13］， CPT2 是骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞中負(fù)責(zé)脂肪酸氧化代謝的重要酶［14］， 兩者均在脂代謝環(huán)節(jié)中顯示出非常重要的作用［15］； AR 和肥胖、 胰島素抵抗、 瘦素抵抗等代謝性疾病有關(guān)［16］。 除了藥物和疾病共同靶標(biāo)外， 與藥物靶標(biāo)相關(guān)的疾病靶標(biāo)還有12 個(gè)， 結(jié)合已有文獻(xiàn)， 推測血脂靈片間接干預(yù)的有 6 個(gè)， 分 別 為 HADHA、 AKT2、 NSDHL、DYRK1B、 PEX2、 ACAD8， 它們通過參與脂肪生成及 代 謝［17-18］、 膽 固 醇 合 成［19］、 甘 油 三 酯 代謝［20］、 甾醇去甲基化［21］、 促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸酶合成［22］等過程來調(diào)節(jié)血脂。

2.2 關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)基因功能和代謝通路分析 在整合藥理學(xué)平臺“關(guān)鍵靶標(biāo)分析” 模塊中， 通過GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對408 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行基因功能分析， 根據(jù)P-Value 顯示前10 個(gè)條目， 見表1，可知基因功能主要涉及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、 ATP 結(jié)合、藥物反應(yīng)、 蛋白結(jié)合、 線粒體、 酶結(jié)合、 蛋白激酶活性、 蛋白磷酸化、 脂肪酸氧化、 蛋白酶活性等多個(gè)條目。

表1 血脂靈片關(guān)鍵靶標(biāo)基因功能Tab.1 Gene functions of key targets for Xuezhiling Tablets

在整合藥理學(xué)平臺“關(guān)鍵靶標(biāo)分析” 模塊中，通過GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對408 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行信號通路分析， 見表2， 可知其主要集中在甲狀腺激素、 促性腺激素釋放激素、 雌激素、 催產(chǎn)素、 脂肪酸降解、 胰島素、 脂肪細(xì)胞因子等信號通路。 文獻(xiàn)報(bào)道， 血脂異常與內(nèi)分泌有著密切關(guān)系， 甲狀腺激素能影響血脂代謝［23］； 體內(nèi)促甲狀腺激素水平較高時(shí)， 高甘油三酯血癥的發(fā)生率較高［24］； 缺乏雌激素會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂， 而補(bǔ)充雌激素可部分糾正血脂異常［25］； 催產(chǎn)素表達(dá)下降可能是肥胖的病理機(jī)制之一［26］。

表2 血脂靈片關(guān)鍵靶標(biāo)通路信息Tab.2 Pathway information of key targets for Xuezhiling Tablets

2.3 “成分-靶標(biāo)-通路” 分析 在整合藥理學(xué)平臺“關(guān)鍵靶標(biāo)分析” 模塊中， 提取P 值前30 的關(guān)鍵通路， 得到與其相關(guān)的核心靶標(biāo)及血脂靈片藥效成分， 它們涉及多個(gè)方面， 如能量代謝通路， 甲狀腺激素、 促性腺激素釋放激素、 雌激素、 催產(chǎn)素等多個(gè)內(nèi)分泌通路， 以及阿茲海默癥、 內(nèi)分泌代謝疾病、 結(jié)直腸癌等疾病， 與這些通路相關(guān)的核心靶標(biāo)有90 個(gè)， 血脂靈片藥效成分有95 種， 其中何首烏成分19 種， 決明子成分27 種， 共有成分5 種， 澤瀉成分26 種， 山楂成分28 種， 見圖2。 藥效成分對于血脂異常的干預(yù)主要集中在能量代謝和內(nèi)分泌相關(guān)通路的靶標(biāo)上， 95 種藥效成分中有75 種可能通過影響蛋白激酶及蛋白磷酸酶、 線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素C 氧化酶等來參與ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)合成， 從而影響線粒體活性等能量代謝過程； p-茴香醛、 亞油酸、 11-去氧澤瀉醇A 可能作用于腎上腺素、 前列腺素、 胰島素受體等相關(guān)內(nèi)分泌過程， 從而起到調(diào)節(jié)血脂的作用。

圖2 血脂靈片“成分-靶標(biāo)-通路” 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Compounds-targets-pathways” network of Xuezhiling Tablets

2.4 藥效成分透膜吸收及生物利用度預(yù)測 大多數(shù)藥物的給藥途徑是口服， 藥物透膜吸收能力和口服生物利用度對其發(fā)揮藥效起到至關(guān)重要的作用［27］， 其中前者強(qiáng)弱通常由藥物在Caco-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)速率， 即表觀滲透系數(shù) （Papp） 來評價(jià)，Papp＞7.0×10-6cm／s［28］的成分透膜能力較強(qiáng)； 后者強(qiáng)弱用F 來評價(jià)， ≤33%為低， 33% ～66%為中等，＞66%為高［29-30］。 通過“Chemspider” 下載到95 種關(guān)鍵成分的92 個(gè)對應(yīng)結(jié)構(gòu)式， 再應(yīng)用“ACD／Percepta 軟件” 預(yù)測其Papp和F， 結(jié)果見表3， 可知有22 個(gè)滿足相關(guān)要求。

續(xù)表3

續(xù)表3

3 討論

隨著系統(tǒng)生物學(xué)和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展， “網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)” 的概念在2007 年由Hopkins 等［31］首次提出， 是通過構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物” 網(wǎng)絡(luò)來更系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制［32］。中藥復(fù)方為多成分、 多靶點(diǎn)的協(xié)同作用機(jī)制， 可采用該方法初步揭示中藥復(fù)方的復(fù)雜的分子機(jī)制， 近年來廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域研究［33-34］。

藥物在體內(nèi)的吸收、 分布、 代謝、 排泄過程簡稱ADME， 可反映其藥效強(qiáng)弱［35］。 近年來隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、 組學(xué)技術(shù)、 高通量篩選技術(shù)的迅猛發(fā)展， 使本來在體內(nèi)才能被準(zhǔn)確獲取的ADME 相關(guān)指標(biāo)可通過體外計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)進(jìn)行預(yù)測［36］， 既可達(dá)到在中藥復(fù)方中篩選藥效成分的目的， 又縮減了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)指標(biāo)的時(shí)間。

中藥復(fù)方作用機(jī)制的傳統(tǒng)研究方法是將復(fù)方中藥所含化學(xué)成分進(jìn)行分離后篩選活性成分， 但往往會(huì)忽視復(fù)方中各中藥之間的網(wǎng)絡(luò)化協(xié)同作用， 以及治療靶點(diǎn)的復(fù)雜性， 也難以闡釋其配伍的科學(xué)內(nèi)涵［37］。 整合藥理學(xué)平臺結(jié)合大數(shù)據(jù)和模型計(jì)算，從人工智能、 數(shù)據(jù)挖掘、 網(wǎng)絡(luò)科學(xué)出發(fā)， 分析和預(yù)測中藥復(fù)方中藥效物質(zhì)及其治療相關(guān)疾病的分子機(jī)制， 可為中藥質(zhì)量評價(jià)、 分子機(jī)制闡釋、 新藥研發(fā)等提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐［38］。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺， 通過對血脂靈片治療血脂異常的分子機(jī)制進(jìn)行分析， 又結(jié)合ADME預(yù)測尋找相關(guān)Q-marker。結(jié)果表明， 血脂靈片可作用于能量代謝相關(guān)靶標(biāo)， 以及能量代謝、 內(nèi)分泌等相關(guān)通路， 該預(yù)測與現(xiàn)有血脂異常相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。 但22 種成分作為血脂靈片Q-marker 數(shù)量略多， 今后將進(jìn)行體內(nèi)ADME 和分子機(jī)制研究， 以確認(rèn)最終的Q-marker。