響應(yīng)面法優(yōu)化酸提小米多糖工藝與模型診斷

諸愛士，沈林芬，趙軍子

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023)

小米，又名粟，是一年生草本谷類植物的種子——谷子脫皮后得到的產(chǎn)品，因其顆粒直徑大小約為1～2 mm，故名。小米具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，它不僅可作為食糧供食用，又可釀酒，還可入藥，具有清熱、清渴，滋陰，補(bǔ)脾腎和腸胃，利小便、治水瀉等功效。小米含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、脂肪、鈣和多酚[1]，研究發(fā)現(xiàn)，小米還含有多糖[2-3]。多糖是由多個(gè)單糖(可相同也可不同)經(jīng)糖苷鍵聚合而成的碳水化合物，以天然大分子的形式廣泛存在于高等植物、真菌、動(dòng)物等體內(nèi)。近年來，多糖已成為研究的熱門，見之報(bào)道的有關(guān)多糖的中文文獻(xiàn)就超過十萬篇。有研究用不同的方法提取多糖的，如用熱水提取茯苓多糖[4]，用95%的乙醇提取玉屏風(fēng)總多糖[5]，用堿溶液提取黑木耳多糖[6]，用酸溶液提取海帶多糖[7]126，用CO2超臨界萃取綿馬貫眾多糖[8]，用纖維素酶輔助提取錦葵多糖[9]，用微波輔助從肉桂皮中提取多糖[10]，用超聲波輔助從佛手瓜中提取多糖[11]171；也有用多重手段協(xié)同輔助提取的，如超聲協(xié)同酶輔助提取蘆蒿多糖[12]，超聲輔助酸液提取薏苡仁多糖[13]，超聲輔助堿液提取沁洲黃小米多糖[14]，表面活性劑協(xié)同酶解提取荔枝核多糖[15]，等等。還有研究多糖功效的，如黑木耳多糖具有降血脂的功能[6]，貫葉連翹多糖具有抗氧化和抗菌作用[16]，茶籽多糖具有清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的效果及還原能力[17]，馬齒莧多糖具有抗腫瘤的功效以及能提高免疫力[18]，苦丁茶多糖具有降血糖的功效[19]，山芝麻多糖能抑制α-葡萄糖苷酶的活性[20]，烏賊生殖腺多糖有吸濕保濕的性能[21]，黑木耳多糖能使大豆蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性有明顯改善[22]，蘭坪被毛孢粗多糖有延緩衰老的功效[23]，等等。小米多糖的熱水提取[2]和堿液提取[3，14]已見報(bào)道，但用酸溶液提取小米多糖尚未見報(bào)道。酸能使多糖的糖苷鍵斷裂而獲得更多的單糖和低聚糖[7]126，同時(shí)用酸溶液提取多糖可使其收率和純度得到提高，且所得多糖的生物活性較高[24]54，但對酸的摩爾濃度有一定要求。為此，研究了小米多糖的酸溶液提取，先單因素考察了酸摩爾濃度(鹽酸水溶液，mol/L)、液固質(zhì)量比(去離子水與小米質(zhì)量比)、提取時(shí)間(h)及提取溫度(℃)等對多糖收率(mg/g)的影響；進(jìn)一步采用4因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝條件，使多糖的收率更高，并對建立的模型進(jìn)行了分析評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗(yàn)材料：小米，購于杭州物美超市，產(chǎn)地遼寧省朝陽市。

試驗(yàn)藥劑：葡萄糖(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，硫酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，苯酚(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)，鹽酸(工業(yè)品，江蘇常熟市恒宏氟化工科技有限公司)。

試驗(yàn)儀器：DHG9053型智能鼓風(fēng)干燥箱(浙江杭州藍(lán)天儀器有限公司)，F(xiàn)A2004B型電子分析天平(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)，DKS14型電熱恒溫水浴鍋(浙江嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司)，800電動(dòng)離心機(jī)(上海梅香儀器有限公司)，WFJ型可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小米的預(yù)處理

在干燥箱中于50 ℃干燥恒重，稱重分包待用。

1.2.2 小米多糖提取

取5.0 g干燥的小米裝入500 mL三口燒瓶，按需要考察的液固質(zhì)量比(10.0、15.0、20.0、25.0、30.0)加入待考察摩爾濃度(2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 mol/L)的鹽酸水溶液，將燒瓶固定在設(shè)定好需要考察的提取溫度(50.0、60.0、70.0、80.0、90.0 ℃)的恒溫水浴鍋中提取至需要考察的時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)，提取過程結(jié)束后迅速取出燒瓶，倒出混合料液，用少量水清洗燒瓶，合并后測量其總體積，取適量提取液裝入離心管放入離心機(jī)，在2 000 r/min下離心10 min，移取上層清液，按下述多糖質(zhì)量濃度測量方法測定提取液中的多糖質(zhì)量濃度，并計(jì)算出多糖收率。

1.2.3 多糖質(zhì)量濃度測量及收率計(jì)算

多糖的質(zhì)量濃度按文獻(xiàn)[2，7]所述的硫酸-苯酚法，通過測定溶液吸光度再經(jīng)換算而得到。小米多糖的提取收率按式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

式(1)中：Y為小米多糖提取收率，mg/g；X為提取液中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；M為每次提取試驗(yàn)小米投料量，g。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素考察：整顆小米投料，料液不攪拌，提取1次，分別對酸摩爾濃度、液固質(zhì)量比、提取時(shí)間、提取溫度等4個(gè)因素進(jìn)行考察，觀察其對小米多糖收率的影響。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)：依據(jù)單因素考察結(jié)果，以上述4個(gè)因素為自變量，以收率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，完整的試驗(yàn)設(shè)計(jì)由29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(包括中心點(diǎn)的5個(gè)重復(fù)試驗(yàn))組成，試驗(yàn)隨機(jī)進(jìn)行，得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用二次非線性多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，并且得到回歸系數(shù)。二次非線性多項(xiàng)式模型見式(2)：

(2)

1.2.5 統(tǒng)計(jì)及分析方法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的自變量和對應(yīng)獲得的響應(yīng)值采用Design-Expert 8.0.6.1程序進(jìn)行非線性多項(xiàng)回歸和分析。多項(xiàng)式模型的回歸質(zhì)量采用方程的決定系數(shù)R2評價(jià)，回歸系數(shù)的顯著性采用F檢驗(yàn)和p值判斷。當(dāng)p<0.05時(shí)，差異顯著。

2 結(jié)果與討論

圖1 酸摩爾濃度對多糖收率的影響Fig.1 Effects of molar concentration of acid on extraction yield of polysaccharides

2.1 單因素考察

2.1.1 酸摩爾濃度對收率的影響

圖2 液固質(zhì)量比對多糖收率的影響Fig.2 Effects of liquid-solid mass ratio on extraction yield of polysaccharides

酸能促進(jìn)消除高聚物分子細(xì)胞壁間的物理和化學(xué)作用，有利于破壁，從而在相同的提取時(shí)間內(nèi)使更多的多糖從細(xì)胞中擴(kuò)散到提取液中，使多糖收率提高；但提取液的酸摩爾濃度過高會(huì)發(fā)生多糖的酸催化水解，這反而會(huì)減小多糖收率。在液固質(zhì)量比20.0、提取時(shí)間1.0 h和提取溫度60.0 ℃的條件下，考察了提取液酸摩爾濃度分別為2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 mol/L時(shí)對多糖收率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可看出，酸摩爾濃度從2.0 mol/L增大到2.4 mol/L，多糖收率大幅度增加，但繼續(xù)升高提取液的酸摩爾濃度，所得多糖收率反而有明顯的下降。收率最大值出現(xiàn)在酸摩爾濃度2.4 mol/L時(shí)，以下試驗(yàn)酸摩爾濃度采用2.4 mol/L。

2.1.2 液固質(zhì)量比對收率的影響

不同的液固質(zhì)量比可明顯影響多糖收率(圖2)，這是提取過程中的傳質(zhì)推動(dòng)力(溶質(zhì)在提取液與物料間的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之差)及分子擴(kuò)散傳遞阻力(溶液黏度等)隨液固質(zhì)量比變化所致。增加液固質(zhì)量比可降低溶液中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，減小黏度，從而增大推動(dòng)力，提高傳質(zhì)速度，相同時(shí)間內(nèi)增加多糖收率。但當(dāng)液固質(zhì)量比增大到一定程度后，該效果就不再明顯，反而過高的液固質(zhì)量比會(huì)增加提取后的操作成本，也會(huì)因后續(xù)操作時(shí)間的延長導(dǎo)致多糖損失而使收率有所降低。在酸摩爾濃度2.4 mol/L、提取時(shí)間1.0 h和提取溫度60.0 ℃的條件下，考察了液固質(zhì)量比分別為10.0、15.0、20.0、25.0、30.0時(shí)對多糖收率的影響(圖2)。由圖2可看出，當(dāng)液固質(zhì)量比從10.0增加到20.0時(shí)，多糖收率明顯提高，但繼續(xù)升高液固質(zhì)量比，多糖收率卻明顯減少。收率最大值出現(xiàn)在液固質(zhì)量比20.0時(shí)，因此，以下試驗(yàn)液固質(zhì)量比采用20.0。

圖3 提取時(shí)間對多糖收率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對收率的影響

提取液滲入小米細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞的破壁及多糖分子借助提取液從物料內(nèi)傳遞到提取液中需要一定的時(shí)間，因此提取時(shí)間也是影響多糖收率的一個(gè)因素。時(shí)間不足，則多糖還沒有盡可能多地被提取，使收率不高；但時(shí)間過長，又會(huì)使已經(jīng)提取到液相中的多糖在酸性環(huán)境下受溫度的影響發(fā)生降解，從而導(dǎo)致多糖收率降低。在酸摩爾濃度2.4 mol/L、液固質(zhì)量比20.0和提取溫度60.0 ℃的條件下，考察了提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)對多糖收率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間從0.5 h延長到1.0 h，多糖收率明顯提高，但繼續(xù)延長提取時(shí)間，多糖收率反而減少。收率最大值出現(xiàn)在提取時(shí)間1.0 h時(shí)，因此以下試驗(yàn)提取時(shí)間采用1.0 h。

圖4 提取溫度對多糖收率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides

2.1.4 提取溫度對收率的影響

溫度的高低會(huì)影響到溶液的黏度和分子擴(kuò)散系數(shù)的大小。溫度高則溶液黏度降低和分子擴(kuò)散系數(shù)增大，能加快傳遞速度，有利于傳質(zhì)，相同時(shí)間內(nèi)使多糖收率增加；溫度低則溶液黏度高，使得傳質(zhì)阻力大，傳遞速度小，同時(shí)分子擴(kuò)散系數(shù)小，也不利于傳質(zhì)，多糖收率就低；但過高的溫度會(huì)使提取到液體中的多糖分解，導(dǎo)致收率減少。在酸摩爾濃度2.4 mol/L、液固質(zhì)量比20.0和提取時(shí)間1.0 h的條件下，考察了提取溫度分別為50.0、60.0、70.0、80.0、90.0 ℃時(shí)對多糖收率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取溫度從50.0 ℃升高到70.0 ℃，多糖收率有顯著的提升，但繼續(xù)升高溫度，多糖收率有增加但增速不明顯。考慮到能耗及多糖在高溫下的降解，提取溫度以80.0 ℃為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取的合適條件是酸摩爾濃度2.4 mol/L、液固質(zhì)量比20.0、提取時(shí)間1.0 h和提取溫度80.0 ℃，多糖收率達(dá)到了45.74 mg/g，比熱水提取小米多糖有明顯增加，且能減少提取時(shí)間[2]。但單因素試驗(yàn)條件的選擇是點(diǎn)，而最佳的條件不一定正好落在所選擇的點(diǎn)上。因此，以單因素試驗(yàn)考察的4個(gè)因素為自變量，以所得的各因素最佳水平為中心，以多糖收率為響應(yīng)值Y(mg/g)，采用4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，對提取條件和收率作進(jìn)一步的優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和所得結(jié)果列于表1。

2.2.2 模型擬合

由Design-Expert 8.0.6.1軟件對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到了小米多糖收率與各因素實(shí)際值間關(guān)系的四元二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)表達(dá)式：

(3)

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和提取結(jié)果Table 1 Experimental design and extraction yield

2.2.3 模型方差分析與診斷

模型的方差分析結(jié)果見表2。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for regression equation

表2(續(xù))

由表2可知，模型具有F=293.34、p<0.000 1、R2=0.996 6與Adj.R2=0.993 2等這些數(shù)值，這說明獲得的二次非線性多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)間的擬合度較高，該模型能有效地描述多糖收率與各因素間的關(guān)系。失擬項(xiàng)p>0.05，不顯著。從F值可以看出4個(gè)因素均對收率有非常顯著的影響，其強(qiáng)弱排序是提取時(shí)間>液固質(zhì)量比>提取溫度>酸摩爾濃度；因素間的4項(xiàng)交互項(xiàng)與各因素的平方項(xiàng)均有非常顯著的影響，這說明響應(yīng)值與因素間不是簡單的一次關(guān)系；這些與單因素考察所得結(jié)果基本上一致。同時(shí)可從軟件中導(dǎo)出模型的診斷圖(圖5)。

圖5 模型充分性診斷Fig.5 Diagnostic plots for model adequacy

由圖5(a)可知預(yù)測值與試驗(yàn)實(shí)際值的對應(yīng)關(guān)系，所有的點(diǎn)非常接近45°線，說明預(yù)測值非常接近試驗(yàn)值,該模型成功地表達(dá)了過程變量與響應(yīng)值之間的相關(guān)性。圖5(b)顯示了內(nèi)部學(xué)生化殘差的正態(tài)分布概率，當(dāng)點(diǎn)的分布相當(dāng)接近一條直線時(shí)，說明方差沒有絲毫的偏差。圖5(c)顯示了內(nèi)部學(xué)生化殘差與運(yùn)行號(hào)的點(diǎn)分布毫無規(guī)律，并均在范圍內(nèi)。圖5(d)顯示所有的杠桿值均小于1，說明在模型中沒有異常值或有意想不到的錯(cuò)誤。圖5(e)顯示的是不同試驗(yàn)點(diǎn)回歸系數(shù)的差異，且均在范圍內(nèi)，結(jié)果顯示在所有的對任何一個(gè)回歸系數(shù)的觀測中沒有不恰當(dāng)?shù)挠绊?。圖5(f)中的考克斯距離值均在確定的范圍內(nèi)，故沒有強(qiáng)有力的證據(jù)證明在試驗(yàn)數(shù)據(jù)中有影響的觀測值。因此，在模型的分析診斷中沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的問題，并且表明所開發(fā)的模型具有較高的準(zhǔn)確性[25]。

2.2.4 優(yōu)化值與響應(yīng)面

運(yùn)行Design-Expert 8.0.6.1程序，可得到多糖收率有最大值的提取條件組合是：酸摩爾濃度2.4 mol/L、液固質(zhì)量比20.3、提取時(shí)間1.2 h、提取溫度80.2 ℃，預(yù)測收率為47.13 mg/g。將其中兩個(gè)因素固定于中心值，另外兩個(gè)因素間關(guān)系的3D圖可以從軟件中導(dǎo)出，見圖6。

圖6 不同因素組合對多糖收率的影響Fig.6 Effects of different combined conditions on polysaccharides yield

圖6中，若立面上因素的邊線平坦則該因素對多糖收率的影響弱，邊線陡則影響強(qiáng)[11]175；等高線圖形接近圓形則交互影響小，接近橢圓形則交互影響強(qiáng)[26]。通過對圖6中的6個(gè)圖形比較可以發(fā)現(xiàn)，各因素對響應(yīng)值的影響強(qiáng)弱順序是：提取時(shí)間>液固質(zhì)量比>提取溫度>酸摩爾濃度；各因素組合的等高線圖形均呈現(xiàn)出橢圓形，說明因素兩兩之間有交互影響。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

在酸摩爾濃度2.4 mol/L、液固質(zhì)量比20.3、提取時(shí)間1.2 h、提取溫度80.2 ℃條件下提取多糖，平行試驗(yàn)3次，獲得多糖的平均實(shí)際收率為46.26 mg/g(n=3，RSD=5.8‰)，與模型預(yù)測值47.13 mg/g基本上一致，這表明擬合得到的二次非線性多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型能用來準(zhǔn)確預(yù)測小米多糖提取收率。

3 結(jié) 語

綜上所述，本文研究了在酸性環(huán)境下從小米中提取多糖的特性，單因素對多糖提取收率的影響趨勢與文獻(xiàn)[24]56報(bào)道的結(jié)果一致；采用響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化使多糖的收率最大化，并用統(tǒng)計(jì)方法來識(shí)別和量化變量對多糖收率的影響。確定最優(yōu)提取條件如下：酸摩爾濃度2.4 mol/L、液固質(zhì)量比20.3、提取時(shí)間1.2 h與提取溫度80.2 ℃。在最優(yōu)條件下，模型預(yù)測的多糖最高收率可達(dá)到47.13 mg/g，試驗(yàn)實(shí)際的收率為46.26 mg/g，兩者吻合；響應(yīng)面圖和方差分析表明，各因素對響應(yīng)值(多糖收率)有非常顯著的影響；模型的方差分析和診斷表明所得模型與試驗(yàn)結(jié)果的擬合高度一致。