葛根素-吡乙酰胺共晶的制備與表征

金 煬，陸 祥，蔣成君

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023；2.桐廬縣中醫(yī)院，杭州 310028)

葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，能夠擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)血液循環(huán)、降低血壓、預(yù)防心律失常、抗血小板聚集及提高機(jī)體免疫力，對冠心病的治療起到很好的作用[1-3]。然而，葛根素水溶性差，導(dǎo)致口服給藥后生物利用度低，影響其藥效，這成為制約葛根素制劑應(yīng)用的瓶頸之一[4]。為解決葛根素水溶性差的問題，藥學(xué)工作者嘗試了很多方法，張焦等[5]采用納米晶作為固體微粒穩(wěn)定劑制備Pickering乳液，將水難溶性藥物葛根素溶解于油相中；馮玉蘭等[6]制備了葛根素PEG-PE納米膠束。但是目前這些方法仍然存在一些問題，如Pickering乳液引入了甘油酯、油等油相組成，PEG-PE納米膠束難以穩(wěn)定等。因此，解決葛根素的溶解度低問題是當(dāng)前藥學(xué)工作者面臨的難題。藥物共晶無需改變活性藥物分子的結(jié)構(gòu)，通過共晶形成物修飾藥物理化性質(zhì)，這提供了一個(gè)改善難溶性有效成分溶解性的新方案[7]。張建軍等[8]以咖啡因?yàn)楣簿纬晌铮苽涑呻y溶性藥物槲皮素的共晶，共晶在50%乙醇水溶液中的溶解度為3.627 mg/mL，共晶溶解度相對于槲皮素提高了13.6倍。Sowa等[9]通過溶劑輔助碾磨法制備了漆黃素異煙酰胺、咖啡因和煙酰胺的共晶，在50∶50(V/V)乙醇-水溶液中研究其溶解度，漆黃素的溶解度為2.89 mg/mL，漆黃素異煙酰胺、漆黃素咖啡因、漆黃素?zé)燉０返娜芙舛确謩e為4.43、5.29和7.43 mg/mL。共晶技術(shù)是提高黃酮類化合物溶解度的重要方法[10-11]，但目前鮮見對葛根素共晶的報(bào)道。黃酮類化合物易與酰胺類化合物形成共晶，因此，筆者對異煙酰胺、茶堿、吡乙酰胺這3種酰胺類化合物進(jìn)行篩選，制備葛根素共晶，并對其溶解性進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

葛根素，純度98%；吡乙酰胺，純度99%；異煙酰胺，純度98%，購于薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；堿純度98%，購于梯希愛化成工業(yè)有限公司。差示掃描量熱分析儀STA449F3，德國耐馳儀器公司；傅里葉紅外光譜儀VERTEX 70，布魯克科技有限公司；X射線衍射儀Ultima IV系列，日本津島公司；掃描電子顯微鏡SU1510，日本日立高新技術(shù)公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-5500，上海元析儀器有限公司。

1.2 葛根素共晶的制備

準(zhǔn)確稱取葛根素與異煙酰胺、茶堿、吡乙酰胺分別按摩爾比1∶1，1∶2，1∶3投料，置于燒杯中，在超聲下用甲醇∶水=1∶1(V/V)的溶液將其溶解，室溫條件下緩慢揮發(fā)溶劑，得到固體，過濾，減壓干燥得到不同摩爾比組成的固體，待用。

1.3 X射線衍射分析

通過粉末X射線衍射來初步判斷樣品是否有可能是共晶。若有新的衍射峰生成則有可能是共晶。X射線衍射，射線源為Cu/Kα(λ=0.154 nm)，掃描范圍為5°～40°(2θ)，掃描步長為0.05°，掃描速度為6°/min，電源設(shè)置為40 kV，40 mA。

1.4 差示掃描量熱分析

以空白坩堝為參比，待測樣品10 mg左右，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下進(jìn)行測試，測試溫度范圍為50～250 ℃，升溫速率為5 K/min。

1.5 傅里葉紅外光譜分析

樣品通過溴化鉀壓片的方式進(jìn)行測定，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.6 電子掃描顯微鏡分析

直接將樣品粘在導(dǎo)電膠帶上進(jìn)行噴金，在5.0 kV電壓下獲得不同放大倍數(shù)的掃描電子顯微鏡照片。

1.7 葛根素共晶的溶解度測試

1.7.1 確定入射光波長的最大值λmax

稱取0.037 9 g葛根素，在25 mL容量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度為1.516 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以去離子水為基液，用紫外可見分光光度計(jì)的波長掃描功能對葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長掃描，得到最大吸收波長為331 nm。同理得到吡乙酰胺的最大吸收波長為192 nm，共晶的最大吸收波長為267 nm。

1.7.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.1 g葛根素，在100 mL容量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，再用規(guī)格為5 mL的移液槍精密吸取5 mL于50 mL容量瓶中定容，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL。取7支試管，精密配制一系列不同質(zhì)量濃度的葛根素、制吡乙酰胺、共晶溶液，每種質(zhì)量濃度再重復(fù)做3組，求平均值。以去離子水為空白，使用紫外可見分光光度計(jì)在波長331 nm處測定溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.3 配制飽和溶液

分別稱取若干葛根素、吡乙酰胺及共晶于燒杯中，加入適量去離子水，超聲15 min后靜置，直到有少量看得見的固體，否則就繼續(xù)加入葛根素以達(dá)到飽和狀態(tài)。過濾溶液，取濾液清液稀釋若干倍，在選定的入射波長下測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到溶液質(zhì)量濃度，從而得到溶質(zhì)的溶解度。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛根素共晶的篩選

葛根素的結(jié)構(gòu)中有6個(gè)羥基，存在與共晶形成物通過多種化學(xué)計(jì)量比形成共晶的可能。然而，如果共晶形成物與葛根素的摩爾比過大，容易導(dǎo)致共晶形成物單一物質(zhì)的析出，不能形成共晶。篩選異煙酰胺、茶堿、吡乙酰胺，分別按摩爾比1∶1、1∶2、1∶3通過溶劑揮發(fā)結(jié)晶的方法得到不同比例組成固體，X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)分析如圖1所示。

圖1 不同比例組成固體的XRD圖譜Fig.1 XRD pattern of samples with different proportions

由圖1可知，只有當(dāng)葛根素-吡乙酰胺以1∶2組成時(shí)，XRD圖顯示在15.9、19.6、21.05、23.35、26.2有新的特征峰出現(xiàn)，而原先葛根素中6.5、7.95、11.6、13.85的特征峰以及吡乙酰胺在6.4、14.45、17.5的特征峰均消失了，這符合共晶形成的標(biāo)志。然而葛根素與吡乙酰胺都有氫鍵合成元結(jié)構(gòu)，如圖2所示，但兩者以何種方式形成共晶有待進(jìn)一步研究。

圖2 葛根素與吡乙酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure formula of puerarin and piracetamide

2.2 差示掃描量熱分析

葛根素-吡乙酰胺共晶的粉末差示掃描量熱(differential scanning calorimetry, DSC)分析結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，產(chǎn)物在163.78 ℃有一個(gè)吸熱峰，不同于葛根素179.34 ℃以及吡乙酰胺158.15 ℃的熔點(diǎn)而是產(chǎn)生了一個(gè)新的熔點(diǎn)，這也進(jìn)一步證明了有新的物質(zhì)生成，這個(gè)新的吸熱峰即共晶的熔點(diǎn)。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

圖4所示為葛根素-吡乙酰胺共晶的傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared, FTIR)分析譜圖。

圖4 葛根素-吡乙酰胺共晶的FTIR圖Fig.4 FTIR spectra of puerarin-piracetamide cocrystal

由圖4可知，葛根素位于3 429 cm-1時(shí)的羥基—OH伸縮振動(dòng)和位于1 635 cm-1的，羰基振動(dòng)峰，以及吡乙酰胺位于3 450 cm-1的氨基—NH伸縮振動(dòng)和位于1 690 cm-1的酰胺中羰基的振動(dòng)峰，在葛根素-吡乙酰胺共晶中發(fā)生了偏移，分別到了3 398 cm-1和1 630 cm-1的較低波數(shù)。這是因?yàn)楦鸶氐牧u基作為氫鍵的給體，吡乙酰胺中的羰基作為氫鍵的受體形成了氫鍵；也可能是葛根素的羰基為氫鍵的受體，吡乙酰胺中的氨基作為氫鍵的給體也形成了氫鍵。紅外譜圖顯示形成共晶后，基團(tuán)的特征吸收并沒有消失，這可能與葛根素、吡乙酰胺有多個(gè)可以成氫鍵的基團(tuán)有關(guān)。

2.4 掃描電子顯微鏡分析

將葛根素、吡乙酰胺晶體及葛根素-吡乙酰胺共晶進(jìn)行掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)分析，結(jié)果如圖5所示。

從掃描電鏡中可以發(fā)現(xiàn)共晶與兩個(gè)原料藥的形態(tài)有明顯的不同。葛根素粉末在放大2 000倍的條件下，形態(tài)為柱狀；吡乙酰胺晶體在放大1 100倍的條件下，形態(tài)為棱柱狀；葛根素-吡乙酰胺共晶在放大100倍的條件下，形態(tài)特性為片狀。這進(jìn)一步驗(yàn)證了共晶的形成。

圖5 葛根素、吡乙酰胺及其共晶的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of puerarin, piracetamide and their cocrystal

2.5 溶解度測試結(jié)果

葛根素、吡乙酰胺以及共晶的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。

圖6 葛根素、吡乙酰胺及其共晶的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curves of puerarin, piracetamide and their cocrystal

由圖6可知，葛根素、吡乙酰胺及共晶的吸光度與質(zhì)量濃度之間呈線性關(guān)系，R2分別為0.998、0.993和0.993，適合用于溶解度分析。將制備得到的葛根素、吡乙酰胺及共晶的飽和溶液分別置于紫外可見分光光度計(jì)中測吸光度，測得的吸光度值分別為0.169 5、0.522 2、0.459 1，根據(jù)稀釋倍數(shù)得到葛根素的溶解度為0.003 g/mL，吡乙酰胺的溶解度為0.532 g/mL，共晶的溶解度為0.062 g/mL，共晶的溶解度介于二者之間，是葛根素溶解度的20倍。

3 結(jié) 語

篩選異煙酰胺、茶堿、吡乙酰胺為共晶形成物，分別按摩爾比1∶1、1∶2、1∶3通過溶劑揮發(fā)結(jié)晶的方法得到不同比例組成的固體。將制備的樣品進(jìn)行XRD分析表征，當(dāng)葛根素與吡乙酰胺以摩爾比1∶2組成得到的晶體在圖譜上分別是15.9、19.6、21.05、23.35、26.2的特征峰，而葛根素中6.5、7.95、11.6、13.85的特征峰以及吡乙酰胺6.4、14.45、17.5的特征峰均消失了。采用DSC分析，結(jié)果表明，有新的熔點(diǎn)產(chǎn)生，共晶在163.78 ℃左右有一個(gè)吸熱峰，不同于葛根素的179.34 ℃以及吡乙酰胺158.15 ℃的熔點(diǎn)，這也進(jìn)一步證明了有新的物質(zhì)生成。用傅里葉紅外光譜分析葛根素-吡乙酰胺樣品，出現(xiàn)了特征峰的偏移；用掃描電子顯微鏡分析葛根素、吡乙酰胺與葛根素-吡乙酰胺共晶形態(tài)，觀察到表面形態(tài)有著較大的區(qū)別，進(jìn)一步確定了葛根素和吡乙酰胺產(chǎn)生了共晶，共晶體的溶解度是葛根素溶解度的20倍。