GTF2IRD1基因多態(tài)性與先天性小耳畸形發(fā)病的關系△

馮濤 錢瑾 王悅 章慶國

先天性小耳畸形是僅次于唇腭裂的第二高發(fā)的顱面部出生缺陷，其在新生兒的發(fā)病率高達6.5/10 000[1]。小耳畸形可單獨發(fā)生，也可出現(xiàn)在綜合征型疾病中，非綜合征型占所有小耳畸形的65%，而對其遺傳機制的揭示卻遠不如綜合征型小耳畸形[2，3]。

遺傳和環(huán)境因素對小耳畸形的發(fā)生均有貢獻，但研究認為排除孕期用藥和接觸致畸劑外，遺傳因素對該病的發(fā)生起主要貢獻[4～6]。全基因組關聯(lián)研究已經(jīng)證實神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常是導致半側顏面短小(小耳畸形為其代表表型)的重要病因[7]。目前小耳畸形的發(fā)病機制主要有“神經(jīng)嵴細胞擾亂”和“局部缺血”假說，最新研究表明神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常在小耳畸形的發(fā)病中起關鍵作用[4]。神經(jīng)嵴細胞產(chǎn)生于胚胎神經(jīng)管背側，經(jīng)分層、遷移至第一、二鰓弓，和間質細胞互相作用分化成為面部各個器官[8]；先天性小耳畸形是由于胚胎期第一、二鰓弓發(fā)育受阻或發(fā)育異常導致的[9]。目前已鑒定的小耳畸形風險基因多為調(diào)控胚胎期發(fā)育的基因，如HOXA2、FGF3、SIX2、HMX1等[10～13]，這些基因大都屬于同源盒基因(homeobox gene)家族，它們是控制胚胎發(fā)育的主要基因，對器官發(fā)生和細胞分化調(diào)控起關鍵作用。同源盒基因家族的多個成員已被證實為小耳畸形的風險致病因素[14,15]，GTF2IRD1是重要的同源盒家族成員，其編碼蛋白包含5個GTF2I-樣重復，每個重復包含1個HLH模體，可與其他HLH蛋白互作，作為轉錄調(diào)控因子調(diào)節(jié)諸多基因表達，進而影響顱面部發(fā)育。Bayarsaihan等[16]通過研究同源盒GTF2IRD1基因的產(chǎn)物BEN蛋白，發(fā)現(xiàn)其大量出現(xiàn)在神經(jīng)管、顱面部的軟骨、骨胳和軟組織中，提示GTF2IRD1基因與第一、二鰓弓及其分化器官密切相關。為了探討GTF2IRD1這一同源盒基因是否參與小耳畸形的發(fā)生，本研究采用候選基因關聯(lián)研究策略對328例小耳畸形患者和500例健康人進行分析比較，以發(fā)掘更多的小耳畸形風險基因，為進一步揭示小耳畸形遺傳病因提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 以2015～2017年張家口市婦幼保健院以及中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院診治的328例8歲左右小耳畸形患者(患者組)和500例30歲左右健康人群對照樣本(對照組)為研究對象，所有對象在3代內(nèi)無親緣關系。小耳畸形表型鑒定采用Nagata分型標準，包括：耳甲腔型82例，臘腸型201例，耳垂型45例；其中，男246例(75%)，女82例，右側197例(60%)，左側131例。

1.2標簽SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點挑選 下載千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)漢族人群(CHB)的GTF2IRD1基因以及上下游各10 kb內(nèi)所有變異位點。由于小耳畸形為罕見病，故在挑選標簽SNP時僅保留了最小等位基因頻率>0.01的常見變異位點。使用Haploview軟件[17]挑選標簽SNP，具體參數(shù)為：r2閾值為0.6，多位點檢驗LOD閾值為3.0，最后挑選了4個變異位點作為標簽SNP，分別為rs3735504、rs519462、rs571514、rs13244286。

1.3基因分型 兩組每例對象采取靜脈血2 ml，使用天根公司的全血DNA提取試劑盒完成DNA提取，使用Nanodrop對DNA質量進行檢測。使用飛行質譜(Sequenom)法完成挑選的4個SNPs的基因分型，該工作由北京康普森生物技術有限公司完成，分型工作嚴格按照標準實驗流程進行。

1.4數(shù)據(jù)分析 對于4個位點所有樣本的基因型，患者組和對照組中并未發(fā)現(xiàn)丟失率有顯著差異，同時對對照樣本進行Hardy-Weinberg檢驗后未發(fā)現(xiàn)P<0.05的位點，提示樣本為隨機采樣所得。使用plink軟件對所有位點進行l(wèi)ogistic檢驗，并對性別和年齡以及地理來源(按照南北人群分)進行了校正[18]。多重檢驗校正采用Bonferroni檢驗；采用Haploview構建連鎖不平衡區(qū)塊。使用SHAPEIT進行單體型構建，并采用Impute2進行基因組填充(使用千人基因組計劃中的漢族人群作為背景)[19]，僅保留填充后Info值>0.5的變異位點，然后使用SNPtest進行關聯(lián)分析，關聯(lián)分析時同樣使用性別和年齡以及地理來源(按照南北人群分[18])作為協(xié)變量對關聯(lián)結果進行校正。使用Seattleseq對所有變異位點進行功能注釋，使用GTEx對顯著關聯(lián)的變異位點進行基因表達分析。原位雜交結果來源于MGI(Mouse Genome Informatics)數(shù)據(jù)庫。

2 結果

經(jīng)飛行質譜法對患者組和對照組GTF2IRD1基因的4個位點進行基因分型，位點分型成功率>97.2%，且這4個位點的對照數(shù)據(jù)均不背離Hardy-Weinberg平衡檢驗，因此將4個位點全部納入后續(xù)的關聯(lián)研究。關聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)4個位點的P值均小于0.05，且rs13244286(P=0.0 007 097，OR=1.66)的P值經(jīng)校正后仍然顯著(表1)。該位點位于GTF2IRD1基因編碼HLH模體的第22和23外顯子中間的內(nèi)含子上。

為了進一步揭示GTF2IRD1基因的單體型與小耳畸形之間的關聯(lián)性，本研究構建了連鎖不平衡區(qū)塊(圖1)，可見，除rs13244286外，其它三個位點落入同一個連鎖不平衡區(qū)塊內(nèi)。構建這4個位點的單體型并進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)GAGA單體型和小耳畸形顯著關聯(lián)(P=0.002 6， Perm-P=0.007 8)(表2)。以千人基因組計劃的中國人群數(shù)據(jù)作為背景信息，使用基因組填充的方法推測出GTF2IRD1基因內(nèi)另外12個SNP位點的基因型信息，然后對這所有16個(4個檢測加上12個推測)變異位點進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，除rs13244286外，又有3個SNP位點(rs13246861、rs34158545、rs73137122)與小耳畸形顯著關聯(lián) (表3)；該結果進一步證實了GTF2IRD1基因與小耳畸形顯著相關。利用軟件對上述4個顯著關聯(lián)的變異位點進行基因注釋，發(fā)現(xiàn)這4個位點均落于GTF2IRD1基因的內(nèi)含子內(nèi)。

表1 GTF2IRD1基因內(nèi)4個標簽SNP和小耳畸形的關聯(lián)分析結果

注：SNP：單核苷酸多態(tài)性；HWE：Hardy-Weinberg檢驗；OR：比值比

為了進一步了解上述4個SNP位點如何影響GTF2IRD1基因功能進而與小耳畸形相關聯(lián)，本研究將他們提交至表型和組織特異性表達數(shù)據(jù)庫(genotype and tissue-specific gene expression，GTEx)，該數(shù)據(jù)庫并未記錄這4個位點在特異性器官內(nèi)是否為eQTL位點，但GTF2IRD1在肌肉和骨骼組織高表達，提示該基因仍可能與頜面部骨骼肌肉發(fā)育相關(圖2)?？紤]到GTF2IRD1可能在胚胎早期影響器官發(fā)育，本研究考察了該基因的小鼠胚胎原位雜交結果，發(fā)現(xiàn)其在胚胎期特別是在胚胎中晚期各器官分化過程中高度表達(圖3)，這與頜面部器官分化發(fā)生在胚胎發(fā)育中后期相吻合。

表2 GTF2IRD1基因內(nèi)4個SNP位點構建的單體型以及和小耳畸形的關聯(lián)分析結果

注：Perm-P：經(jīng)過10 000個置換檢驗后獲得的P值

表3 基因組填充后的GTF2IRD1基因內(nèi)的SNP位點和小耳畸形關聯(lián)分析結果

注：SNP：單核苷酸多態(tài)性；info：基因組填充后的可信值，越接近1越可信；MAF：最小等位基因頻率；HWE：Hardy-Weinberg平衡檢驗P值；BonferroniP值，經(jīng)過Bonferroni多重檢驗校正的P值。

圖1 GTF2IRD1基因4個SNP位點構建的連鎖不平衡圖 該圖上方展示SNP位點間的距離關系,中間顯示的是SNP編號,下方倒三角展示位點間的連鎖不平衡關系。使用D’反映兩兩位點間的連鎖不平衡關系:灰色,D’=1 and LOD≥2;白色,D’<1且LOD≥2;白色,D’<1且LOD<2

3 討論

小耳畸形在我國高發(fā)，但對其遺傳機制的研究仍處于早期階段，目前僅明確證實4p16.2及HOXA2基因與非綜合征型小耳畸形相關[12,13,15,20]，其他基因，如：HMX1、FGF3等與綜合征型小耳畸形相關[11,21,22]。目前公認與顱面部發(fā)育畸形相關的基因主要來自同源盒基因家族，動物模型顯示該家族成員如Hoxa1、Hoxb1、Six1、Six4等突變可導致顱面畸形，甚至出現(xiàn)小耳畸形[4]。郝少娟等[23]應用Affymetrix SNP 6.0芯片技術篩選出5個先天性小耳畸形的候選致病基因，其中4個基因MSX1、MSX2、GSC和HOXA2 均為同源盒家族基因。GTF2IRD1也是重要的同源盒家族成員，本研究通過候選基因關聯(lián)分析對GTF2IRD1基因和小耳畸形進行關聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)多個變異位點與國人小耳畸形顯著相關。

圖2 表型和組織特異性表達數(shù)據(jù)庫記錄的GTF2IRD1表達情況

圖3 GTF2IRD1在小鼠胚胎期以及各胚層和分化器官內(nèi)的表達情況 該圖左側顯示的是小鼠胚胎分化的各個結構組織,上方顯示的是小鼠不同胚胎發(fā)育階段,如TS1 E0～2.5代表胚胎發(fā)育的第1個Theiler期即第0～2.5天。方框內(nèi)顯示的是各階段GTF2IRD1基因的表達量,白色表示該階段無該組織結構,方框內(nèi)帶圓圈表示對應組織器官該階段無數(shù)據(jù),藍色代表基因表達,紅色表示基因不表達,顏色的深淺反映表達量的高低

本研究通過飛行質譜法檢測患者組和對照組的基因分型，關聯(lián)研究所發(fā)現(xiàn)的1個顯著關聯(lián)的變異位點位于GTF2IRD1的第22和23外顯子中間的內(nèi)含子上，而與該內(nèi)含子相鄰的外顯子均參與HLH模體，因此推測和這個顯著關聯(lián)位點共連鎖的致病突變可能位于編碼HLH模體的DNA序列內(nèi)，它(它們)可導致HLH模體功能異常，進而導致顱面部畸形。研究發(fā)現(xiàn)[24]敲除GTF2IRD1基因后，小鼠顱面部成像顯示顱骨和頜骨都出現(xiàn)異常，并發(fā)現(xiàn)GTF2IRD1基因下游靶點Goosecoid的調(diào)控出現(xiàn)失調(diào)，說明GTF2IRD1是哺乳動物顱面和認知發(fā)育的遺傳決定因子；Canales等[25]研究表明GTF2IRD1突變可導致Williams-Beuren綜合征，特征表型為血管、頜面部骨骼以及神經(jīng)發(fā)育異常；Howard等[26]構建GTF2IRD1基因敲除小鼠模型后發(fā)現(xiàn)突變小鼠的表型與Williams-Beuren綜合征表型相似，如：顱面骨胳畸形、耳發(fā)育畸形等；其他動物模型研究同樣發(fā)現(xiàn)GTF2IRD1敲除小鼠模型出現(xiàn)鰓弓畸形、顱面部不對稱發(fā)育、耳發(fā)育異常等表型[27，28]；這些證據(jù)均提示GTF2IRD1突變可能是導致耳發(fā)育畸形的病因之一。

本研究通過對同源盒基因GTF2IRD1與小耳畸形關聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)了1個顯著關聯(lián)位點rs13244286，并利用Impute2進行基因組填充后分析又發(fā)現(xiàn)3個位點與小耳畸形顯著相關(BonferroniP<0.05)。通過eQTL分析后發(fā)現(xiàn)他們均不參與基因表達調(diào)控，且這4個位點位于GTF2IRD1基因的HLH模體附近，推測和關聯(lián)位點連鎖的致病突變可能位于編碼HLH模體的DNA序列上。采用基因測序的手段挖掘對應DNA序列的致病突變將是后期對GTF2IRD1基因研究的重點，同時在更大樣本中驗證本研究結果并挖掘新的致病突變，進而闡明致病突變導致小耳畸形發(fā)生的機制也是今后的研究方向。