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      S100B蛋白在C57/BL6J小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)*

      2019-01-24 06:23:26高險(xiǎn)亭盧嶺張瑩瑩梁耕田楊麗萍
      關(guān)鍵詞:耳蝸神經(jīng)節(jié)老年性

      高險(xiǎn)亭 盧嶺 張瑩瑩 梁耕田 楊麗萍

      S100B蛋白是神經(jīng)組織蛋白中的一種不含糖、脂和磷的酸性鈣結(jié)合蛋白,主要分布在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞以及某些神經(jīng)元中[1]。研究發(fā)現(xiàn),S100B蛋白在腦血管疾病、顱腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、阿爾茨海默癥、精神分裂癥等患者體內(nèi)血清中表達(dá)升高,并與神經(jīng)癥狀的嚴(yán)重程度呈正比[2]。老年性聾的發(fā)病機(jī)理還不清楚,聽(tīng)神經(jīng)退化原因尚未明確,有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)幼、老年小鼠耳蝸內(nèi)S100B蛋白表達(dá)有差異[3],S100B蛋白表達(dá)是否與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞老化有關(guān),值得研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)組織學(xué)方法,檢測(cè)2月齡和12月齡C57BL/6J小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGC)中S100B蛋白表達(dá),探討S100B蛋白在老年性聾發(fā)病中的作用。

      1 材料與方法

      1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取SPF級(jí)C57BL/6J小鼠40只,雌雄各半。2月齡組20只,體重 l0~15 g; 12月齡組20只,體重25~40 g。所有動(dòng)物正常飲食,排除中耳及內(nèi)耳疾病,行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

      1.2ABR閾值檢測(cè) 控制室溫20±2 ℃,動(dòng)物用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉后,采用Nicolet Compass系統(tǒng)的專用電阻檢測(cè)儀,安插針式電極,記錄電極刺入前顱頂正中穿透皮膚至顱骨骨膜,置于冠狀縫中點(diǎn)處,給聲耳及對(duì)側(cè)耳后皮下分別刺入?yún)⒖茧姌O和接地電極。TDH-39型耳機(jī)給聲,聲源距耳廓1 cm,誘發(fā)電位用信號(hào)處理機(jī)疊加處理,刺激聲為交替短聲,重復(fù)率10次/秒。帶通濾波為32~3 000 Hz,掃描時(shí)間10 ms,疊加512次;以引出可重復(fù)出現(xiàn)ABR波Ⅱ的最小刺激聲強(qiáng)度作為其反應(yīng)閾。

      1.3血清標(biāo)本采集和處理 兩組各取10只小鼠內(nèi)眥靜脈取血,每次采血量0.8 ml左右,3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,取上清液,多次離心直至澄清,-20 ℃保存。嚴(yán)格按照小鼠血清S100B蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求檢測(cè)各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、求得回歸方程。采用ELISA法檢測(cè)血清S100B蛋白的吸光度,根據(jù)回歸方程和吸光度求得S100B蛋白濃度。

      1.4石蠟切片制作 兩組各取小鼠10只快速引頸脫臼斷頭處死,迅速取出雙側(cè)顳骨,打開(kāi)聽(tīng)泡,暴露耳蝸,并在蝸尖鉆孔,于4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)4 ℃冰箱內(nèi)固定20 h,PBS(pH 7.4)沖洗,10%EDTA(pH 7.4)X軸縱向切片(厚度4 μm),烤干后行HE染色,光鏡下觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

      1.5免疫組化染色檢測(cè)S100B蛋白表達(dá) 每張切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精至水化后,蒸餾水沖洗,用3%過(guò)氧化氫室溫孵育切片10 min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。將適量的枸櫞酸(pH=6.4)抗原修復(fù)液注入燒杯內(nèi)置于水浴鍋中加熱至90 ℃,15 min后室溫冷卻,PBS沖洗3 min。對(duì)經(jīng)過(guò)上述過(guò)程處理后的切片標(biāo)本,分別滴加濃度為1∶200兔抗鼠S100B多克隆抗體(abcom),37 ℃孵育 2小時(shí),4 ℃過(guò)夜;用PBS緩沖液洗2 min×3次,滴加非生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG輔助劑,室溫孵育15 min;PBS緩沖液洗2 min×3次,非生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG,室溫孵育15 min;PBS緩沖液洗2 min×3次;DAB鏡下控制顯色,水洗,復(fù)染,脫水,中性樹(shù)膠封片,用PBS緩沖液代替一抗作為標(biāo)本染色的陰性對(duì)照。

      結(jié)果判斷:陽(yáng)性染色為胞膜、胞漿及胞核中出現(xiàn)棕黃或者棕黑色顆粒。每張免疫組化切片取2個(gè)400倍視野,選取底回中著色的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞所占的區(qū)域作為陽(yáng)性表達(dá)面積,采用Image-Pro Plus6.0圖像分析儀測(cè)其陽(yáng)性染色面積和平均光密度值(IOD),每次結(jié)果計(jì)算三次求均值。

      表1 兩組小鼠ABR反應(yīng)閾、血清S100B含量、SGC計(jì)數(shù)及其蛋白表達(dá)比較

      注:*與2月齡小鼠比較,P<0.05

      2 結(jié)果

      2.1兩組ABR閾值 兩組小鼠ABR閾值見(jiàn)表1,可見(jiàn)12月齡組小鼠ABR閾值明顯高于2月齡小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),符合老年性聾。

      2.2兩組血清S100B含量 兩組小鼠血清S100B含量見(jiàn)表1,可見(jiàn)12月齡小鼠血清中的S100B含量比2月齡高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      2.3兩組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞HE染色結(jié)果 200倍鏡下觀察2、12月齡C57/BL6J小鼠耳蝸HE染色整體觀,SGC位于耳蝸內(nèi),圖1a示2月齡組毛細(xì)胞排列整齊,血管紋清晰,圖1b示12月齡組毛細(xì)胞部分缺失,血管紋萎縮;800倍鏡下見(jiàn)2月齡組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較密集,形態(tài)完整,胞核大(圖1c);12月齡小鼠SGC分布松散,胞核濃縮變小,呈萎縮性改變(圖1d)。經(jīng)IPP13計(jì)數(shù),12月齡小鼠中SGC數(shù)量較2月齡組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

      圖1 兩組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鏡下HE染色圖片 a、b分別示200倍鏡下觀察,2(a)、12(b)月齡組C57/6J小鼠耳蝸HE染色整體觀;c、d分別示800倍鏡下SGC染色,12月齡(d)小鼠SGC較2月齡組(c)明顯減少

      2.4兩組S100B蛋白表達(dá)結(jié)果 S100B在小鼠耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)有表達(dá),主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核中,2月齡組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中見(jiàn)部分胞膜和胞漿染色(圖2a),12月齡組胞核中見(jiàn)大量表達(dá)(圖2b)。由表1可見(jiàn)S100B在12月齡小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)面積較2月齡組大,平均光密度值也比2月齡小鼠大,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      3 討論

      老年性聾是伴隨機(jī)體衰老而出現(xiàn)的以高頻聽(tīng)力下降為主的雙側(cè)對(duì)稱性感音神經(jīng)性聾,其發(fā)病機(jī)理還不清楚,病理特點(diǎn)多以毛細(xì)胞缺失或螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化為主[4]。C57BL/6J小鼠是研究較成熟的一種老化性動(dòng)物模型[5],文中結(jié)果顯示,12月齡C57BL/6J小鼠ABR反應(yīng)閾較2月齡小鼠高,且12

      圖2 兩組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞S100B蛋白免疫組化染色圖片(×400) 2月齡SGC中部分胞膜和胞漿染色(a),12月齡組胞核中見(jiàn)大量表達(dá)(b)

      月齡小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞部分缺失,血管紋萎縮,SGC計(jì)數(shù)減少;鏡下觀察,2月齡小鼠SGC胞漿小核大,分布密集,12月SGC胞大核小,核濃縮,某些呈空泡樣改變,是神經(jīng)細(xì)胞衰退的細(xì)胞學(xué)變化,與人類老年性耳蝸形態(tài)學(xué)改變一致。

      近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血清或腦脊液中S100B水平與神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性[6],腦損傷后血液中升高的S100B可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一;也有學(xué)者將S100B蛋白描述為腦的“C反應(yīng)蛋白”[7]。S100B蛋白作為鈣結(jié)合蛋白后來(lái)被發(fā)現(xiàn)為損傷相關(guān)模式分子(damage associated molecular patterns,DAMP),DAMP被認(rèn)為是一系列與細(xì)胞死亡和組織損傷有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)分子,可以作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)來(lái)激活炎癥反應(yīng)[8],生理濃度下它可推動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育和損失修復(fù),而高濃度的S100B對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用[9]。在各種原因致神經(jīng)元損失過(guò)程中,反應(yīng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化,導(dǎo)致大量S100B生成,可通過(guò)引起鈣超載、升高一氧化氮濃度促使神經(jīng)纖維纏結(jié)等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12月齡小鼠血清中S100B含量高于2月齡小鼠,結(jié)合兩組小鼠SGC形態(tài)學(xué)觀察,推測(cè)血清S100B含量低于0.2 μl/g可能為生理需要量,促進(jìn)螺旋神經(jīng)元發(fā)育和修復(fù),而相對(duì)高濃度0.80 μl/g可能通過(guò)某種信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)鈣超載,激活炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

      C57BL/6J小鼠隨月齡增加螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不同程度凋亡或壞死,符合人類衰老的進(jìn)程,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示12月齡鼠血清中S100B含量偏高,免疫組化示S100B蛋白在兩組小鼠耳蝸SGC均有表達(dá),但分布部位和密度不同,2月齡組主要表達(dá)于胞膜和胞漿,12月齡組的胞核見(jiàn)大量表達(dá),且S100B陽(yáng)性表達(dá)面積較2月齡組大,表明老年鼠耳蝸SGC中S100B表達(dá)增多。細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心,在細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、分化中起著重要作用,推測(cè)S100B參與細(xì)胞抑制周期相關(guān)進(jìn)程;既往研究表明[11]在正常人體內(nèi)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)隨著年齡增加不斷積累,說(shuō)明RAGE與衰老之間有密切關(guān)系,并在一定度上影響了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。已有研究證明隨年齡增大RAGE在SGC中的表達(dá)增多且參與老年性聾的發(fā)病過(guò)程[12];此外,S100B激活神經(jīng)細(xì)胞中的Ras-MEK-ERK1 / 2-NF-κB通路,并導(dǎo)致GTP酶、Rac1/Cdc42和神經(jīng)突生長(zhǎng)的激活[13];S100B作為RAGE的配體之一[14],是否為兩者的結(jié)合激發(fā)相關(guān)信號(hào)分子以促進(jìn)衰老的進(jìn)程,值得進(jìn)一步探討。

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