冷鮮雞冷藏保存過程中菌群結(jié)構(gòu)變化分析

桂國弘，楊 華，朱江群，朱建芬，肖英平，徐 娥，*

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.余杭區(qū)余杭街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江 杭州 311121； 4.余杭區(qū)塘棲鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江 杭州 311109)

冷鮮雞是指經(jīng)檢疫檢驗(yàn)后屠宰的雞胴體，迅速冷卻使其溫度至0～4 ℃，并保持在0～4 ℃溫度下加工、流通和零售的鮮雞肉[1]。我國是肉類的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，冷鮮雞由于營養(yǎng)價(jià)值高、口感好等特點(diǎn)，越來越得到市場(chǎng)的認(rèn)可，成為雞肉消費(fèi)的趨勢(shì)[2]。但冷鮮雞在屠宰加工過程中易受到微生物的污染，污染的微生物在低溫冷藏條件下仍可利用雞肉中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖[3]，既影響食品安全，也導(dǎo)致冷鮮雞肉產(chǎn)品貨架期縮短。目前對(duì)冷鮮雞的保質(zhì)期暫無明確的規(guī)定，同時(shí)對(duì)于冷鮮雞菌群結(jié)構(gòu)的變化也研究較少。本研究從冷鮮雞冷藏保存過程中反映其腐敗變質(zhì)的參數(shù)和微生物結(jié)構(gòu)變化角度出發(fā)，探究冷鮮雞在冷藏期間雞肉中揮發(fā)性鹽基氮含量、菌落總數(shù)、大腸埃希菌總數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為制定冷鮮雞的保質(zhì)期標(biāo)準(zhǔn)提供參考，也為冷鮮雞污染微生物控制技術(shù)的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

25只冷鮮雞樣品采自華東地區(qū)一家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)，放入無菌袋中，置于4 ℃保藏。

無菌袋購于青島海博生物技術(shù)有限公司；緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG)購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自美國Zymo Research公司。

Eppendorf 5427 R臺(tái)式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SW-CF-IF 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 樣品制備

冷鮮雞在4 ℃保藏第0、1、3、5、7 天時(shí)，各取5只在無菌條件下對(duì)半分開，其中一部分分割雞肉，用于揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定；另一部分放置于無菌袋中，加入生理鹽水沖洗(m/V=1∶1)，并用手握住無菌袋猛烈振蕩1 min，取出雞肉樣品，菌液用于微生物平板計(jì)數(shù)并進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析[4]。

1.3 揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定

揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)按照《GB 2707—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》方法測(cè)定。

1.4 菌落總數(shù)和大腸桿菌數(shù)測(cè)定

菌落總數(shù)、大腸埃希菌數(shù)分別按照《GB 4789.2—2016食品微生物學(xué)檢測(cè) 菌落總數(shù)》《GB 4789.38—2012食品微生物學(xué)檢測(cè) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》方法測(cè)定。

1.5 微生物基因組DNA提取和16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照試劑盒使用說明提取細(xì)菌DNA。以提取的DNA為模板，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6 高通量測(cè)序

測(cè)序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。采用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)條碼序列匹配雙端測(cè)序序列與樣品，對(duì)條碼序列及引物序列進(jìn)行切除。使用FLASH 1.2.7軟件將雙端序列進(jìn)行融合，得到未加工序列。使用QIIME V1.7.0軟件將序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾后，獲得優(yōu)質(zhì)序列[5-6]，之后通過UCHIME算法將得到的優(yōu)質(zhì)序列與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)嵌合體序列，去除后獲得有效序列[7-8]。使用Uparse 7.0軟件依據(jù)相似性≥97%將質(zhì)控后的有效序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic unit，OUT)[9]。采用QIIME默認(rèn)參數(shù)計(jì)算各樣品的α多樣性指數(shù)和物種分布。為了比較不同冷藏保存時(shí)間的菌群結(jié)構(gòu)差異，使用R軟件(Version 2.15.3)軟件包對(duì)樣品之間的菌群結(jié)構(gòu)相似度進(jìn)行非度量多維尺度(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

將菌落計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算成每克樣品中細(xì)菌的含菌量，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮雞揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)、大腸埃希菌數(shù)變化情況

冷鮮雞的揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)含量隨著保存時(shí)間的延長而逐漸增加(表1)。在冷藏條件下保存第1、3 天，其含量分別為7.27、10.80 mg·(100 g)-1，與第0天的新鮮樣品相比，無顯著差異(P>0.05)。保存第5、7 天時(shí)，TVBN含量分別為14.96、29.84 mg·(100 g)-1，均顯著高于新鮮雞肉樣品濃度(P<0.05)。根據(jù)《GB 2707—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》要求，冷鮮雞肉揮發(fā)性鹽基氮不得超過15 mg·(100 g)-1，因此冷鮮雞冷藏5 d后，其TVBN存在超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。

隨著保存天數(shù)的增加，冷鮮雞肉中的菌落總數(shù)與大腸埃希菌數(shù)量不斷增加(表1)。雞肉中菌落總數(shù)由第0天的4.46×106CFU·g-1增加至第7天的1.87×108CFU·g-1，自第3天起菌落總數(shù)開始顯著增加(P<0.05)。大腸埃希菌總數(shù)在雞肉保存第5 天和第7 天時(shí)顯著高于前3天(P<0.05)。

冷鮮雞肉樣品經(jīng)過了屠宰、脫毛、凈膛、清洗等加工過程，胴體表面易被微生物污染。污染的微生物以雞肉為基質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，因此菌落總數(shù)、大腸埃希菌數(shù)量在保存過程中不斷增加。同時(shí)微生物生長繁殖的過程伴隨著雞肉的腐敗變質(zhì)[10-12]，因此TVBN含量相應(yīng)地持續(xù)升高。

2.2 冷鮮雞菌群高通量測(cè)序

2.2.1 菌群豐富度及多樣性

表1冷鮮雞冷藏保存過程中的揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)和大腸埃希菌數(shù)變化情況

Table1TVBN contents， bacterial colonies and totalE.colicounts of chilled chicken in different days of cold storage

組別Group揮發(fā)性鹽基氮含量TVBN contents菌落總數(shù)Total number of bacterial colonies大腸埃希菌數(shù)Total number of E.coliD05.51±1.56 c(4.46±1.28)×106 c(1.48±1.15)×106 bD17.27±3.05 c(6.81±3.20)×106 c(1.67±0.86)×106 bD310.80±2.13 c(5.15±3.12)×107 b(1.66±1.60)×106 bD514.96±1.39 b(1.32±0.99)×108 a(5.10±1.43)×106 aD729.84±8.56 a(1.87±1.03)×108 a(5.78±1.64)×106 a

D0，D1，D3，D5，D7分別為在4 ℃保藏第0，1，3，5，7天的樣品組。同列數(shù)據(jù)后沒有相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

D0，D1，D3，D5，D7 represented the groups of storage for 0，1，3，5 and 7 days at 4℃. Data without the same letters within the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

經(jīng)過質(zhì)控、過濾等處理后，在25個(gè)樣品中獲得有效序列951 905條，其中各組樣品的有效序列為36 826～39 329條(表2)，樣品間的有效序列差異較小。所獲得的有效序列根據(jù)97%相似性水平進(jìn)行OTU數(shù)量分析，在保存第7天的樣品組OTU數(shù)量顯著降低(P<0.05)；同樣地，反映樣品微生物豐度指數(shù)Chao 1和ACE指數(shù)也顯著降低(P<0.05)。各組樣品的覆蓋度指數(shù)(Good’s coverage)均在0.995～1.000，并且其稀釋曲線已經(jīng)趨于平穩(wěn)(圖略)，表明測(cè)序已趨于飽和，測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有物種，測(cè)序結(jié)果能反應(yīng)雞肉微生物菌群多樣性組成。

通過Venn圖(圖1)可知，在冷鮮雞冷藏保存的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，共有352個(gè)OTU是共有的。但在冷鮮雞4℃保藏第7 天時(shí)，其特有的OTU數(shù)量為110個(gè)，顯著多于冷藏保存5 d內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)特有的OTU數(shù)量。由此看出，菌群數(shù)量隨著冷藏保存時(shí)間的增加其獨(dú)有OTU數(shù)量也增多，表明其菌群多樣性隨著冷藏保存時(shí)間的增加而增多。

2.2.2冷鮮雞冷藏保存過程中菌群結(jié)構(gòu)變化

在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢(shì)菌門(圖2)，其相對(duì)豐度在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組都超過99%。

在不同的冷藏保存期間4種優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度見圖3。變形菌門的相對(duì)豐度隨著冷蔵天數(shù)的增加而增加，冷藏第7天時(shí)變形菌門菌群含量顯著高于冷藏第0、1、3、5 天時(shí)(P<0.05)，相對(duì)豐度由38.13%～46.96%增加到64.50%。厚壁菌門隨著冷藏天數(shù)的增加相對(duì)豐度減少，在冷藏保存第5天和第7天，其相對(duì)豐度分別為27.29%和18.80%，均顯著低于第0 天的50.09%(P<0.05)。放線菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度在不同時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P>0.05)。這與我們前期的研究結(jié)果相一致[4]。

表2各組樣品測(cè)序概況

Table2Overview of sequencing results of each group

組別Group序列數(shù)量SequencesOTU數(shù)量OTUs香農(nóng)指數(shù)Shannon index辛普森指數(shù)Simpson index豐度指數(shù)Chao1 index豐度指數(shù)ACE index覆蓋度指數(shù)Goods coverageD038 962±1 254 654±22 a5.838±0.275 a0.950±0.013650.267±24.747 a672.075±28.511 a0.996±0.0005D139 329±1 638710±24 a5.669±0.290 a0.931±0.018722.948±30.914 a732.598±24.057 a0.995±0.0002D336 850±1 834579±21 a5.499±0.218 a0.938±0.018577.775±20.169 a593.157±16.150 a0.996±0.0002D538 414±2 719607±32 a5.344±0.185 ab0.924±0.012692.252±60.205 a684.271±45.943 a0.995±0.0007D736 826±1 245284±43 b4.499±0.414 b0.871±0.053277.236±41.693 b282.733±39.182 b0.998±0.0002

圖1 不同冷藏保存時(shí)間冷鮮雞表面菌群OTU Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTUs in chilled chickens of different storage days

D01～D05，D31～D35，D51～D55，D71～D75分別為在4℃保藏第0、1、3、5、7天的5個(gè)樣品。D01-D05，D31-D35，D51-D55，D71-D75 represented 5 samples of storage for 0，1，3，5，7 days at 4 ℃圖2 冷鮮雞不同冷藏時(shí)間菌群在門水平上的變化Fig.2 Relative abundance of sequences at phylum level in chilled chickens of different storage days

沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same lowercase letters showed the significant difference(P<0.05).圖3 冷鮮雞不同冷藏時(shí)間4種優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度Fig.3 Four dominant phyla in chilled chickens of different storage days

在屬水平上，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium)為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬(圖4)，這10種菌屬的相對(duì)豐度平均約占整個(gè)菌群的52.24%。

圖4 冷鮮雞在不同冷藏保存時(shí)間10種主要菌屬的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of top 10 genera in chickens of different cold storage days

不同冷藏天數(shù)的冷鮮雞表面的菌落結(jié)構(gòu)變化較大。隨著冷藏天數(shù)的增加，在相對(duì)豐度大于0.1%的屬中，有9個(gè)屬的相對(duì)豐度顯著增加(表3)。其中肉食桿菌屬(Carnobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、巨球菌屬(Macrococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)是典型的肉食腐敗菌[13-14]。假單胞菌屬因其能適應(yīng)低溫環(huán)境，是冷藏肉中的優(yōu)勢(shì)菌也是主要的腐敗菌，同時(shí)能產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物[15-18]。本試驗(yàn)中，假單胞桿菌屬在冷藏保存第7 天時(shí)相對(duì)豐度達(dá)到19.53%，成為冷藏肉的表面優(yōu)勢(shì)腐敗菌，與已有研究結(jié)果一致[19-21]。嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬也是冷鮮肉中的常見腐敗菌，在冷藏過程中快速生長，使肉腐敗變質(zhì)[22-27]。在冷藏過程中，由于這些腐敗菌的增殖，導(dǎo)致冷鮮肉的腐敗，這也與TVBN含量隨著冷藏時(shí)間的延長而升高相一致。乳球菌屬、巨球菌屬的相對(duì)豐度出現(xiàn)了先增加后降低的趨勢(shì)，可能由于其他的菌屬如假單胞菌屬或嗜冷桿菌屬，在冷藏環(huán)境下的大量增殖，導(dǎo)致乳球菌屬、巨球菌屬第5天后的相對(duì)豐度降低。

隨著冷藏天數(shù)的增加，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)、腸球菌屬(Enterococcus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)等10個(gè)菌屬的相對(duì)豐度顯著降低(表4)。值得注意的是，擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、腸球菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬和SMB53等是典型的肉雞腸道內(nèi)容物和糞便中的菌屬[28]。該結(jié)果反映了冷鮮雞在屠宰加工過程中雞肉表面的污染微生物主要來源于肉雞腸道和糞便。

2.2.3 樣品的聚類與非度量多維尺度分析

冷鮮雞表面的菌群結(jié)構(gòu)在冷藏保存過程中發(fā)生一定的變化，根據(jù)各組樣品間的加權(quán)UniFrac距離(圖5)和基于不同保存時(shí)間樣品OTU進(jìn)行非度量多維尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling， NMDS)分析(圖6)。結(jié)果表明，不同保存時(shí)間的樣品表現(xiàn)出不同的聚類趨勢(shì)，特別是在冷藏保存后第7天，菌群結(jié)構(gòu)有顯著不同的聚類。相同天數(shù)樣品菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，不同天數(shù)的樣品相似性較小。

3 結(jié)論

冷鮮雞在冷藏保存過程中，揮發(fā)性鹽基氮含量逐漸升高，特別是在冷藏保存第5天后，其含量已超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)；菌落總數(shù)、大腸埃希菌總數(shù)隨著冷藏時(shí)間的延長而增多；在菌群結(jié)構(gòu)組成方面，肉食桿菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬等腐敗菌的相對(duì)豐度顯著增加，而擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、腸球菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬等肉雞自身來源的污染微生物逐漸降低。說明了冷鮮雞肉的微生物污染起始階段主要受肉雞自身攜帶微生物的污染，而后逐漸演替成腐敗菌為優(yōu)勢(shì)菌群，導(dǎo)致雞肉的腐敗變質(zhì)。

表3冷鮮雞冷藏過程中菌群相對(duì)豐度顯著升高的屬

Table3The genera with significantly enhanced relative abundance in chilled chicken during the increasing days of cold storage

菌屬Genus不同冷藏保存天數(shù)菌群的相對(duì)豐度Relative abundance of the genus in different cold storage days/%01357P值P-value肉食桿菌屬Carnobacterium0.0310.0250.2580.2351.6130.000金黃桿菌屬Chryseobacterium0.7001.6143.0803.4971.2600.018乳球菌屬 Lactococcus1.2963.53015.1846.6305.9130.000巨球菌屬 Macrococcus1.8350.7403.8861.4861.7590.001海洋芽孢桿菌屬M(fèi)arinibacillus0.0000.0000.0000.0000.8880.020假單胞菌屬 Pseudomonas0.1760.3470.7130.57419.5260.000嗜冷桿菌屬 Psychrobacter2.3112.27816.76512.91816.8010.002希瓦氏菌屬Shewanella0.0640.1200.1420.1880.9830.002需鹽桿菌屬Salegentibacter0.0000.0000.0000.0001.4550.041

僅選擇相對(duì)豐度大于0.1%的屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和列出顯著差異的菌屬。下表同。

The genera representing more than 0.1% of the total sequences were compared， and genera showing significant differences were listed. The same as below.

表4冷鮮雞冷藏過程中菌群相對(duì)豐度顯著降低的屬

Table4The genera with significantly reduced relative abundance in chilled chicken during the increasing days of cold storage

菌屬Genus不同冷藏保存天數(shù)菌群的相對(duì)豐度Relative abundance of the genus in different cold storage days/%01357P值P-value不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter17.43827.05912.36911.8264.2930.000擬桿菌屬Bacteroides1.0780.2760.0980.1200.0070.046布勞特氏菌屬Blautia1.1330.5240.3160.2070.1490.044水棲菌屬Enhydrobacter1.1280.7980.9660.5660.1790.006腸球菌屬 Enterococcus12.1741.7211.1921.4810.7420.007埃希氏菌屬 Escherichia6.9143.4431.0462.1010.3350.039Faecalibacterium1.2120.4050.2040.1650.0450.048瘤胃球菌屬Ruminococcus1.4400.5380.1720.0710.0230.001SMB531.8621.9851.8231.6400.5060.006葡萄球菌Staphylococcus1.9181.0231.6980.8040.2010.000

圖5 各樣品菌落結(jié)構(gòu)的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of the dissimilarity of bacterial community structure among the samples

圖6 各樣品菌落結(jié)構(gòu)的NMDS分析Fig.6 Non-metric multi-dimensional scaling (NMDS) of the dissimilarity of bacterial community structure among the samples