腎損傷因子-1在脂多糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用

姜盈盈，陳隆望，林岳，陳新國(guó)，鄭炎焱，盧中秋

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種原發(fā)性或者繼發(fā)性導(dǎo)致腎臟功能急劇下降的綜合征，是臨床上最常見的危急重癥之一。許多因素均可誘導(dǎo)AKI，膿毒癥是造成重癥患者AKI的主要原因之一，其中脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是最重要的誘導(dǎo)因素[1]。腎損傷因子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）是一種最早發(fā)現(xiàn)于非洲綠猴中的甲型肝炎病毒受體（he-patitis A virus receptor，HAVCR1）[2-3]，后來研究發(fā)現(xiàn)也在人類中表達(dá)，主要表達(dá)于近端小管的受損上皮細(xì)胞中并且具有促進(jìn)腎纖維化的作用[4]，在正常人的腎組織細(xì)胞和尿液中均不能檢測(cè)出[5]。雖然KIM-1在多種AKI患者的血清和尿液中檢測(cè)出，并作為早期診斷的分子標(biāo)志物，但是其本身的生物學(xué)作用以及對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)的影響尚未見報(bào)道。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)研究LPS處理人腎小管上皮細(xì)胞并分析KIM-1的表達(dá)在LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，以期為膿毒癥AKI的診斷和預(yù)防探尋新的、簡(jiǎn)便和可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司；Hoechst33342/PI試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司；LPS和CCK-8試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人KIM-1多克隆抗體和兔抗人IL-6多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體、預(yù)染蛋白Marker和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TRIzol試劑、2×Taq PCR Mastermix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase）、DNA Marker和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)：將生長(zhǎng)覆蓋率至90%左右的HK-2細(xì)胞用胰蛋白酶消化，重懸后鋪種于96孔板中，鋪種密度為103個(gè)細(xì)胞/孔。LPS處理組中加入不同濃度的LPS，對(duì)照組加入同體積無菌PBS緩沖液，轉(zhuǎn)染組按照轉(zhuǎn)染試劑說明書配置siRNA轉(zhuǎn)染混合液后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，6 h更換含有100 μg/mL的LPS的完全培養(yǎng)基。5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h后，加入10 μL的CCK-8溶液；加入CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，取上清液于450 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)同時(shí)間點(diǎn)各組OD值計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

1.2.2 Hoechst33342/PI細(xì)胞凋亡雙染實(shí)驗(yàn)：HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)至90%覆蓋率，用胰蛋白酶消化后鋪種于6孔板中，轉(zhuǎn)染組于次日進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染6 h后，處理組和轉(zhuǎn)染組中加入100 μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后低速離心2 min，去上清液后加入1 mL培養(yǎng)基重懸浮細(xì)胞并加入10 μL的Hoechst33342熒光染料，混勻后37 ℃避光染色10 min，1 000 r/min離心5 min，去上清后加入1 mL的1×Buffer A，加入5 μL的PI熒光染料后室溫避光染色10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)：HK-2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化和懸浮后鋪種于6孔板中，鋪種密度為105個(gè)細(xì)胞/孔，處理組分別加入0、10、50和100 μg/mL的LPS，轉(zhuǎn)染組加入siRNA轉(zhuǎn)染混合液6 h后更換含有100 μg/mL的LPS的完全培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。按照TRIzol試劑說明書步驟提取RNA，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA溶液的OD260/OD280，按照cDNA合成試劑盒說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以及Taq酶混合液產(chǎn)品說明書配置PCR反應(yīng)液，按表1所示引物序列設(shè)定擴(kuò)增程序并進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增完成后用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照后用Image J軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值分析，并計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)：藥物處理和細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同上，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并加入含有PMSF的RIPA裂解液，于冰上裂解1 h后通過BCA法測(cè)定總蛋白濃度，加入Loading buffer后煮沸，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜和10%脫脂奶封閉，按照抗體說明書推薦比例對(duì)一抗進(jìn)行稀釋并于4 ℃對(duì)醋酸纖維素膜孵育過夜，PBST清洗后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBST清洗后并用ECL反應(yīng)液孵育，暗室中進(jìn)行曝光顯影定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以 ±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制率 HK-2細(xì)胞分別加入0、10、50和100 μg/mL的LPS溶液，作用24 h后加入CCK-8并檢測(cè)細(xì)胞生存率，結(jié)果顯示10、50和100 μg/mL濃度組的LPS均能抑制HK-2細(xì)胞增殖，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。用終濃度為100 μg/mL的LPS溶液處理HK-2細(xì)胞，分別處理0 h、24 h和48 h后，CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，在對(duì)照組中各時(shí)間段OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在LPS處理組中，處理24 h和48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)均受到一定程度的抑制，與0 h組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 LPS對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 KIM-1蛋白和基因的表達(dá) HK-2細(xì)胞加入終濃度為0、10、50和100 μg/mL的LPS處理48 h后，RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對(duì)照組（0 μg/mL）比，LPS處理組中KIM-1基因和蛋白的表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在LPS處理組中IL-6在mRNA和蛋白水平也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，見圖2。

2.3 細(xì)胞凋亡 HK-2經(jīng)100 μg/mL的LPS處理48 h后，用胰蛋白酶消化并進(jìn)行Hoechst33342/PI染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組中Hoechst33342和PI都呈弱陽性，而在LPS處理組細(xì)胞中，Hoechst33342染色呈強(qiáng)陽性，PI染色呈弱陽性，提示LPS處理組細(xì)胞主要為細(xì)胞凋亡狀態(tài)，見圖3。

2.4 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染 HK-2細(xì)胞鋪種于6孔板，次日轉(zhuǎn)染靶向KIM-1基因的siRNA，6 h后更換含有100 μg/mL的LPS的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在siRNA轉(zhuǎn)染組中，KIM-1基因的表達(dá)水平明顯低于siRNA-NC組，同時(shí)IL-6的表達(dá)水平也明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)增殖的影響 轉(zhuǎn)染靶向KIM-1基因的siRNA的HK-2細(xì)胞加入100 μg/mL的LPS后分別培養(yǎng)24 h和48 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在siRNA轉(zhuǎn)染組中，處理24 h和48 h后siRNA-1和siRNA-2組細(xì)胞增殖能力均強(qiáng)于siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖2 不同濃度LPS處理HK-2細(xì)胞后對(duì)KIM-1和IL-6基因表達(dá)的影響

圖3 Hoechst33342染色觀察LPS處理對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.6 靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染靶向KIM-1基因的siRNA的HK-2細(xì)胞加入100 μg/mL的LPS后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，按照試劑盒說明書進(jìn)行Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照，結(jié)果顯示siRNA-1和siRNA-2組中Hoechst33342染色強(qiáng)度均低于siRNA-NC組，提示靶向KIM-1基因siRNA轉(zhuǎn)染可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，見圖6。

3 討論

KIM-1是一種跨膜糖蛋白，在各種誘因?qū)е碌哪I損傷過程中表達(dá)上調(diào)，并且還與腎損傷修復(fù)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及及腎纖維化過程有關(guān)。在膿毒癥誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中KIM-1出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，可能作為炎癥介導(dǎo)因子參與多種慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。KIM-1是一種由上皮細(xì)胞受損后表達(dá)于細(xì)胞表面的免疫球蛋白超家族成員之一。KIM-1在受傷的上皮細(xì)胞中表達(dá)增加，并將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞處以清除細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞，由KIM-1上調(diào)表達(dá)介導(dǎo)的受損細(xì)胞被吞噬細(xì)胞所吞噬將影響AKI嚴(yán)重程度[6]。

KIM-1作為一種指標(biāo)，應(yīng)用于近端腎小管損傷的早期檢測(cè)，臨床研究發(fā)現(xiàn)在確診AKI患者的血清和尿液中KIM-1含量升高，較敏感，可以做為膿毒癥AKI在早期診斷的指標(biāo)。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過高糖條件體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)高糖組細(xì)胞KIM-1的mRNA和蛋白水平于12 h處理后明顯上升，KIM-1基因的siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白1和纖維連接蛋白表達(dá)明顯減少，研究結(jié)果提示KIM-1可能參與了糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程[7]。還有研究證實(shí)HK-2細(xì)胞在缺氧復(fù)氧模型中KIM-1的表達(dá)與HIF-1α相關(guān)，而且HIF-1α可以與KIM-1基因啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合參與基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此推測(cè)KIM-1作為HIF-1α下游分子參與腎損傷和修復(fù)過程[8]。

圖4 LPS處理的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)KIM-1和IL-6基因表達(dá)的影響

圖5 siRNA轉(zhuǎn)染和LPS處理不同時(shí)間對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)建立LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞炎癥模型，研究KIM-1在LPS介導(dǎo)的炎癥過程中可能發(fā)揮的生物學(xué)作用及參與的信號(hào)途徑。結(jié)果顯示，LPS處理的HK-2細(xì)胞出現(xiàn)KIM-1基因mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達(dá)，但是參與的信號(hào)途徑尚未闡明，不過有報(bào)道指出腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和MAPK活化誘導(dǎo)的腎損傷可介導(dǎo)KIM-1的表達(dá)，并且RAS阻斷劑和p38 MAPK激酶抑制劑可以調(diào)節(jié)KIM-1的表達(dá)[9]。LPS通過誘導(dǎo)MAPK信號(hào)途徑活化介導(dǎo)下游分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已經(jīng)得到廣泛的研究，大腸桿菌LPS通過MAPK活化誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞熱休克蛋白25的表達(dá)[10]，LPS通過激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)途徑激活Smad途徑，通過誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而發(fā)揮促肝纖維化作用[11]，LPS誘導(dǎo)小鼠牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-13需要先通過活化p38信號(hào)途徑，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[12]。因此，可以推測(cè)LPS可能通過誘導(dǎo)p38 MAPK激酶信號(hào)途徑活化介導(dǎo)KIM-1的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控。

圖6 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)經(jīng)LPS處理的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，可通過與細(xì)胞中IL-6受體結(jié)合可溶性刺激靶細(xì)胞并介導(dǎo)缺血性AKI和AKI小鼠肺損傷[13-14]。IL-6在缺血性AKI中的作用機(jī)制可能與腎小管細(xì)胞中反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3激活有關(guān)[15]。在通過藥物干預(yù)炎癥反應(yīng)的研究中，有學(xué)者報(bào)道深低溫治療可以通過抑制STAT-3的磷酸化以及下游IL-6和TNF-α的表達(dá)，從而緩解由LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，有效保護(hù)神經(jīng)功能[16]。吡格列酮通過調(diào)節(jié)NF-κB/STAT3、CREB/BDNF途徑和中樞5-羥色胺能神經(jīng)傳遞，從而減輕LPS誘導(dǎo)的抑郁樣行為[17]。在本研究中，LPS處理的HK-2細(xì)胞表現(xiàn)出增殖受抑制，并且伴隨KIM-1和IL-6 mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達(dá)，但是尚未對(duì)其是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及其分子機(jī)制做相關(guān)研究，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可能是通過由LPS激活NF-κB/STAT3信號(hào)途徑活化所介導(dǎo)。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KIM-1的下調(diào)表達(dá)對(duì)IL-6的表達(dá)水平具有一定的干預(yù)作用，但是IL-6的表達(dá)水平是否依賴于KIM-1目前尚未見報(bào)道，涉及到的信號(hào)途徑以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。