超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定番茄和土壤中咯菌腈殘留量

張一汀，井樂剛*，張曉波，董見南，劉 峰，陳國峰

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086）

咯菌腈（Fludioxonil）又名氟咯菌腈，其化學(xué)名為4-（2，2-二氟-1，3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-4-基）吡咯-3-腈，結(jié)構(gòu)式見圖1[1]?？┚媸怯扇鹗恐Z華公司（現(xiàn)為先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）開發(fā)的非內(nèi)吸性苯基吡咯類殺菌劑，以商品名“適樂時”（2.5%咯菌腈懸浮種衣劑）、“亮盾”（6.25%精甲霜靈·咯菌腈懸浮種衣劑）、“卉友”（50%咯菌腈可濕性粉劑）等單劑和混劑在我國獲得登記，用于種子處理和作物葉面噴霧?？┚媸且环N觸殺性殺菌劑，主要通過抑制病原真菌滲透信號傳導(dǎo)中絲裂原活化蛋白激酶/組氨酸激酶的磷酸化，導(dǎo)致菌體中的甘油等多醇類增加，從而抑制分生孢子萌發(fā)、芽管伸長及菌絲生長，最終導(dǎo)致病菌死亡[2]?？┚婢哂袕V譜、高效、用量少、毒性低、持效期長、不易與其他殺菌劑發(fā)生交互抗性[3]等特點，對子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌等病原菌引起的種傳和土傳病害有良好的防效，尤其對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病有特效[4-6]。咯菌腈在番茄灰霉病[7]、葉霉病[8]、灰葉斑病[9]、晚疫病[10]等病害的防治中具有一定的應(yīng)用潛力。

圖1 咯菌腈的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure of fludioxonil

關(guān)于咯菌腈的殘留分析，目前已報道的方法包括氣相色譜法（GC）[11-13]、高效液相色譜法（HPLC）[14-17]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[18-23]、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）[24-25]和酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELI?SA）[26]。這些方法或靈敏度、準(zhǔn)確度較低，或操作費(fèi)時，或分析成本較高，而且分析對象大多為葡萄、葡萄酒、果汁、人參等?？┚嬖诜阎袣埩舻姆治龇椒ǎ瑖鴥?nèi)外雖有少量報道[12-13，25]，但這些方法的分析時間都較長，有的靈敏度還較低。鑒于咯菌腈在防治番茄多種病害方面的應(yīng)用前景，本文建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法，以測定咯菌腈在番茄和土壤中的殘留，為研究其在番茄和土壤中的殘留消解動態(tài)奠定基礎(chǔ)，也為測定其在其他樣品中的殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

番茄：宇番一號，產(chǎn)于黑龍江省肇東市試驗地；土壤：取自種植番茄的試驗地。

藥劑與儀器：咯菌腈原藥（純度98.2%），蘇州市奧特萊化工有限公司；乙腈（色譜純），美國Dikma公司；甲酸（色譜純），美國Dikma公司；氯化鈉（分析純），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）凈化劑，天津博納艾杰爾科技有限公司；硅鎂型吸附劑（Florisil），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。ACQUITY超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（電噴霧離子源），美國Waters公司；LXJ-ⅡB高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠；HS501振蕩器、T18高速勻漿儀、MS1渦旋混合儀，德國IKA公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取咯菌腈原藥，用乙腈配制成100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。然后用乙腈將其稀釋，分別配制成0.01、0.05、0.10、0.20、2.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述溶液10 μL，用UPLC-MS/MS測定。以咯菌腈濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品提取

番茄：稱取10.00 g番茄樣品，勻漿后置于50 mL離心管中，再加入10 mL乙腈。用振蕩器振蕩30 min后，加入5 g氯化鈉，再振蕩10 min，3000 r·min-1離心2 min。靜置后，取上層乙腈相約1 mL，待凈化。

土壤：稱取10.00 g土壤樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈及10 mL蒸餾水。用振蕩器振蕩30 min，加入5 g氯化鈉，再振蕩10 min，3000 r·min-1離心2 min。靜置后，取上層乙腈相約1 mL，待凈化。

1.2.3 樣品凈化

將待凈化的乙腈溶液轉(zhuǎn)移至盛有50 mg PSA凈化劑和50 mg硅鎂型吸附劑的離心管中，渦旋30 s，10 000 r·min-1離心3 min。靜置后，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，待UPLC–MS/MS測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）及0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～1.00 min，10%A；1.00～3.00 min，10%A～90%A；3.00～3.10 min，90%A～10%A；3.10～5.00 min，10%A。流速：0.30 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子方式；監(jiān)測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；離子源溫度：20℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L·h-1；錐孔氣流量：50 L·h-1。其他質(zhì)譜條件如表1所示。

1.2.6 添加回收率試驗

取空白番茄和空白土壤樣品各10.00 g，分別向其中添加咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.01、0.10、2.00 mg·kg-1，每個添加水平進(jìn)行5次重復(fù)。按照上述提取和凈化步驟處理后進(jìn)行測定，計算番茄和土壤樣品的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析時間和靈敏度

UPLC-MS/MS法測定咯菌腈殘留量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，曲線的回歸方程為：y=3 412.6x+163.95，r2=0.999 5?？梢?，在0.01～2.00 mg·L-1范圍內(nèi)，峰面積（y）與咯菌腈濃度（x）呈良好的線性關(guān)系。由咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖（圖3）可知，咯菌腈的保留時間為1.86 min。按照S/N（信號/噪聲）=3計算，番茄和土壤中咯菌腈的檢出限（Limit of detection，LOD）均為0.4 μg·kg-1；按照S/N=10計算，相應(yīng)的定量限（Limit of quantification，LOQ）分別為 1.4 μg·kg-1和 1.3 μg·kg-1；最小檢出量分別為4.1×10-3ng和3.8×10-3ng。由此可見，本研究建立的UPLC-MS/MS法分析時間短，靈敏度高。

圖2 UPLC-MS/MS法測定咯菌腈殘留量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve for the determination of fludioxonil residue by UPLC-MS/MS

圖3 咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖Figure 3 MRM chromatogram of standard fludioxonil

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

咯菌腈在番茄和土壤中添加回收試驗的MRM色譜圖分別見圖4和圖5，添加回收試驗的結(jié)果見表2?？梢钥闯?，咯菌腈在番茄和土壤中的平均添加回收率分別在95.96%～103.17%和88.21%～106.88%之間，RSD分別在1.8%～4.6%和1.1%～6.2%之間。上述結(jié)果表明，用此方法測定番茄和土壤中咯菌腈的殘留，準(zhǔn)確度和精密度均較好。

2.3 實際樣品分析

為驗證所建立方法的可靠性，在當(dāng)?shù)厥袌錾腺徶昧朔鸭跋鄳?yīng)的種植土壤樣品各3種，按本研究建立的方法，測定其中咯菌腈的含量。結(jié)果顯示，這些樣品中都未檢出咯菌腈。此外，也對試驗田中按5種方案施用咯菌腈的番茄及相應(yīng)的土壤樣品進(jìn)行了咯菌腈殘留的分析，結(jié)果如表3所示。其中，番茄樣品處理1、2、3、4、5的施藥劑量分別為54、54、54、108、108 g a.i.·hm-2（a.i.為活性成分），施藥次數(shù)分別為2、3、3、2、3次，采樣距最后一次施藥的間隔分別為3、3、5、3、5 d。土壤樣品處理1、2、3、4、5的田間試驗方案分別與相應(yīng)的番茄樣品相同。表3中的數(shù)據(jù)顯示，番茄及相應(yīng)土壤中咯菌腈的殘留量，隨施藥次數(shù)、施藥劑量的增加而增加，隨采樣距最后一次施藥間隔的縮短而增加。這表明該分析結(jié)果真實地反映了番茄和土壤中咯菌腈的殘留情況，說明本研究建立的檢測方法是可靠的。

表1 咯菌腈多重反應(yīng)監(jiān)測的串聯(lián)質(zhì)譜條件Table 1 UPLC/ESI-–MS/MS parameters for fludioxonil in MRM mode

圖4 空白番茄（A）及添加0.05 mg·kg-1咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品番茄（B）的MRM色譜圖Figure 4 MRM chromatograms of blank tomato（A）and fortified tomato with fludioxonil at 0.05 mg·kg-1（B）

圖5 空白土壤（A）及添加0.05 mg·kg-1咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品土壤（B）的MRM色譜圖Figure 5 MRM chromatograms of blank soil（A）and fortified soil with fludioxonil at 0.05 mg·kg-1（B）

表2 咯菌腈在番茄和土壤中的添加回收率（n=5）Table 2 Recoveries of fludioxonil in tomato and soil samples（n=5）

表3 咯菌腈在番茄和土壤中的殘留量（n=3）Table 3 Residues of fludioxonil in tomato fruit and soil samples（n=3）

3 討論

咯菌腈為苯基吡咯類化合物，在已報道的其殘留檢測方法中，大多以乙腈為提取溶劑[16，18，22-23，25]。為此，本研究也以乙腈為溶劑，參考劉紹文[23]的方法并稍加修改，從番茄和土壤中提取咯菌腈。在提取過程中加入氯化鈉，是為通過鹽析作用而使水相和乙腈相分離，去除水及水溶性雜質(zhì)，并增加咯菌腈在乙腈相中的分配比[14]。本試驗研究了振蕩時間對咯菌腈提取效果的影響。結(jié)果表明，振蕩時間少于30 min時，由于咯菌腈不能充分溶解于乙腈中而使其提取率較低；振蕩時間超過30 min時，提取率與30 min時接近。因此，確定振蕩時間為30 min。番茄中含有糖類、有機(jī)酸、色素等雜質(zhì)，用乙腈提取后需進(jìn)一步凈化。在測定番茄中咯菌腈殘留時，韋典[13]用Florisil、Jankows?ka等[25]用PSA作為樣品前處理的凈化劑。本研究中發(fā)現(xiàn)，在對樣品進(jìn)行前處理時將二者聯(lián)用，凈化效果良好。

根據(jù)咯菌腈的理化性質(zhì)和極性，本試驗選擇填料粒徑為1.7 μm的ACQUITY UPLC BEH C18柱為分析柱。與填料粒徑為5 μm或3.5 μm的色譜柱相比，該柱的柱效更高，分離能力更強(qiáng)。用高效液相色譜法分析咯菌腈殘留時，乙腈-水[14-15]、乙腈-0.1%甲酸水溶液[16]經(jīng)常被用作流動相。本試驗發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時，咯菌腈保留時間短，色譜峰峰形尖銳、對稱，分離效果好，靈敏度高，質(zhì)譜響應(yīng)信號強(qiáng)而穩(wěn)定。因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。咯菌腈極性較弱，在反相色譜柱上有較強(qiáng)的保留，直接采用高比例乙腈進(jìn)行等度洗脫時，共流出雜質(zhì)多，分離效果不好。因此，在分析咯菌腈殘留時，經(jīng)常采用梯度洗脫方式[14-15]。本試驗以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，按照設(shè)定的程序進(jìn)行梯度洗脫，使極性較強(qiáng)的雜質(zhì)先被洗脫，最終使咯菌腈的分離度高，峰形好，保留時間短。

質(zhì)譜的錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)對咯菌腈的裂解有重要影響。本試驗所用的質(zhì)譜監(jiān)測模式為全掃描模式。在電噴霧負(fù)離子模式下，先以流動注射方式對0.05 mg·L-1咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，確定質(zhì)荷比（m/z）246.9的離子為咯菌腈的母離子。通過優(yōu)化錐孔電壓等參數(shù)，使母離子峰信號最強(qiáng)。然后以特征碎片離子m/z 180.1和m/z 126.1為目標(biāo)進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量，使子離子m/z 180.1和m/z 126.1豐度最高。選擇m/z 180.1的子離子為定量離子，m/z 126.1的子離子為定性離子。用MRM掃描方式優(yōu)化后的各質(zhì)譜參數(shù)見表1。

占繡萍等[17]建立了同時測定番茄等蔬菜中咯菌腈等3種農(nóng)藥殘留的HPLC法。咯菌腈的保留時間是7.711 min，最低檢出濃度為0.02 mg·kg-1，最小檢出量為1 ng。韋典[13]建立的檢測咯菌腈等13種農(nóng)藥在番茄中殘留的GC法中，咯菌腈的保留時間是17.063 min，LOQ為0.05 mg·kg-1。Cabizza等[12]用GC法測定了番茄中咯菌腈等12種殺菌劑的殘留消解情況，咯菌腈的保留時間是 16.7 min，LOQ 為 0.04 mg·kg-1。Jankowska等[25]用LC-MS/MS法檢測了番茄中咯菌腈等6種殺菌劑的殘留，咯菌腈的保留時間是13.32 min，LOD為0.002 mg·kg-1，LOQ為0.005 mg·kg-1。本研究中，咯菌腈的保留時間為1.86 min，番茄和土壤中咯菌腈的 LOD 均為 0.4 μg·kg-1，LOQ 分別為 1.4 μg·kg-1和1.3 μg·kg-1，最小檢出量分別為4.1×10-3ng和3.8×10-3ng。通過和上述方法比較可以看出，本方法的分析時間大大縮短，靈敏度也有較大幅度提高。我國尚未規(guī)定番茄中咯菌腈的最大殘留限量（Maxi?mum residue limit，MRL），而美國、日本等國都已進(jìn)行了不同的規(guī)定。國際食品法典委員會（Codex Alimen?tarius Commission，CAC）規(guī)定，番茄中咯菌腈的MRL為0.50 mg·kg-1[27]。由此可見，本方法的靈敏度完全能夠滿足檢測需要。

在劉振庫等[16]、占繡萍等[17]、韋典[13]、Cabizza等[12]、Jankowska等[25]建立的方法中，咯菌腈的平均添加回收率分別為81.85%～92.43%、85.0%～95.0%、83.5%～93.6%、95%～108% 和 85.53%～98.49%，RSD 分別為3.68%～7.90%、0.4%～8.2%、7.2%～9.4%、3%～7% 和20%以下。本研究中，咯菌腈在番茄和土壤中的平均添加回收率分別為95.96%～103.17%和88.21%～106.88%，RSD分別為1.8%～4.6%和1.1%～6.2%。通過和上述方法比較可以看出，本方法的準(zhǔn)確度和精密度均有一定程度提高。

4 結(jié)論

本研究建立了測定番茄和土壤中農(nóng)藥咯菌腈殘留的UPLC-MS/MS分析方法。番茄樣品以乙腈提取，土壤樣品以乙腈水溶液提取，經(jīng)PSA和Florisil凈化，通過ACQUITY UPLC BEH C18柱分離后，用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。該方法線性關(guān)系良好，分析時間短，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，操作簡便，應(yīng)用價值較高。