鋅摻雜碳量子點“關(guān)-開”型熒光探針檢測果蔬中谷胱甘肽的研究

李 宏,華建豪,侯朝祥,王翰墨,田 浩,楊亞玲,李晚誼*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南 昆明 650033；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500)

谷胱甘肽是一種特殊的氨基酸衍生物,由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸3種氨基酸組成,在自然界中以還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形式廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi),還原型為其主要存在形式[1]。GSH分子內(nèi)含有活性巰基,具有保護(hù)肝臟、抗病毒、解毒、抗腫瘤作用,在細(xì)胞的多種基本代謝功能中起抗氧化作用[2]。目前,測定谷胱甘肽的常用方法有：高效液相色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、分光光度法[5]、電化學(xué)法[6]、酶法[7]等。這些方法各有優(yōu)點,但存在操作繁瑣,耗時等不足。熒光分析方法因靈敏度高、快速、簡便、經(jīng)濟,在諸多分析方法中占有優(yōu)勢,尤其是基于發(fā)光碳量子點的熒光分析方法,已發(fā)展成為一種新型有效的方法[8]。

熒光碳量子點(CQDs)是一種尺寸在10 nm 以內(nèi)且單分散的準(zhǔn)球形新型熒光納米材料,是目前最熱門的碳納米材料之一。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比,CQDs具有優(yōu)異的生物相容性,綠色環(huán)保性,親水性,化學(xué)及光穩(wěn)定性等諸多優(yōu)點,是一種理想的分析探針[9-10]。此外,研究發(fā)現(xiàn),通過化學(xué)摻雜能完善CQDs的缺陷從而提高其各方面的性能[11-12]。目前,基于碳量子點的熒光響應(yīng)分析已應(yīng)用于無機金屬離子[13]和有機物[14]的定量測定。

本研究從碳量子點(CQDs)熒光猝滅-恢復(fù)現(xiàn)象出發(fā),以檸檬酸、乙二胺和乙酸鋅為前體,采用一步水熱法制備了一種穩(wěn)定的、高熒光量子產(chǎn)率的藍(lán)色發(fā)光鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs)。在合成的碳量子點中加入Cu2+使其熒光猝滅,再在體系中加入GSH,由于Cu2+-GSH的螯合作用,體系的熒光恢復(fù),進(jìn)而可實現(xiàn)對GSH的選擇性檢測。本方法操作簡單,靈敏度高,成本低,可用于果蔬樣品中GSH的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

G9800A熒光分光光度計(美國安捷倫公司),Tecnai G2 TF30場發(fā)射透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司),X射線衍射儀(XRD,德國Bruker公司),TENSOR27型傅立葉紅外光譜分析儀(德國Bruker公司),UV-2600紫外-可見分光光度計(日本島津公司),XW-800快速混勻器(上海汗諾儀器有限公司),HC-3018R型高速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司),120 mL聚四氟乙烯(PTFE)內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜(上海一凱實驗儀器有限公司),電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

還原型谷胱甘肽、乙酸鋅、三氯乙酸、維生素C、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺均購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司,葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、乙二胺、磷酸氫二鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,CuCl2、NaCl、MgCl2、CaCl2、ZnCl2、KI、FeCl3·6H2O購自天津市化學(xué)試劑三廠。所用化學(xué)藥品及試劑均為分析純,實驗用水為超純水。

GSH提取液的配制：準(zhǔn)確稱取5.0 g三氯乙酸,溶解于純水中并定容至50 mL,配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的提取液備用。

1.2 實驗方法

1.2.1鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs)的制備分別準(zhǔn)確稱取1.0 g的檸檬酸,0.5 g的乙酸鋅溶于100 mL超純水中,超聲10 min使其混合均勻,再加入5 mL乙二胺,室溫下攪拌均勻后將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜中,于180 ℃恒溫加熱6 h,反應(yīng)完成后自然冷卻至室溫,得棕色溶液。將所得溶液過0.22 μm濾膜以除去大顆粒雜質(zhì),再經(jīng)10 000 r/min高速離心15 min,得到鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs),并于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2量子產(chǎn)率的測定將碳量子點配制成溶液后,測試其紫外可見吸收光譜及熒光光譜(λex=350 nm)。將熒光峰的積分面積F及相應(yīng)的吸收值A(chǔ)(λem=440 nm)代入公式：

Φx=ΦS(nx/nS)2(AS/Ax)(Fx/FS)

(1)

式中,Φx為測試樣品的熒光量子效率,ΦS表示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光量子效率,n表示溶劑的折光指數(shù)。實驗中采用的標(biāo)準(zhǔn)物(S)為硫酸奎寧(熒光量子效率為54%)。計算得到熒光量子點產(chǎn)率為37.68%。

1.2.3樣品處理本實驗所用果蔬樣品均購于當(dāng)?shù)爻?云南昆明)。分別準(zhǔn)確稱取洗凈的黃瓜和西紅柿樣品各10 g,充分研磨,勻漿,分別加入10 mL GSH提取液,充分振蕩10 min使提取完全,提取液經(jīng)8 000 r/min 離心10 min后過0.22 μm濾膜,得到的上清液用純水定容至50 mL,待測。

1.2.4測定方法向3 mL的Zn-CQDs(0.5 g/L)溶液中加入1 mL的Cu2+(5 mmol/L)溶液,用pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L)定容至50 mL,靜置10 min備用。

稱取適量GSH,用超純水溶解,配制成不同濃度系列的GSH溶液。取上述經(jīng)Cu2+猝滅的Zn-CQDs溶液1.0 mL,加入不同濃度的GSH儲備液100 μL,用pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L)定容至3 mL,渦旋混勻。于激發(fā)波長λex=348 nm,發(fā)射波長λem=445 nm處測定熒光強度F和試劑空白溶液熒光強度F0。實驗過程示意圖如圖1所示。

圖1 鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs)的制備及檢測GSH的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation of zinc-doped carbon quantum dots (Zn-CQDs) and their application for GSH detection

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點的合成與表征

本實驗通過一步水熱法制備了Zn-CQDs。以乙酸鋅作為鋅摻雜的反應(yīng)前體可提高熒光量子產(chǎn)率,同時改變Zn-CQDs的電負(fù)性提高選擇性[15]。如圖2A所示,與不摻鋅的CQDs相比,Zn-CQDs的發(fā)射光譜出現(xiàn)紅移,且量子產(chǎn)率提高9.68%,證明了Zn-CQDs的合成以及鋅摻雜的改性作用。

圖2B為Zn-CQDs的透射電鏡圖(TEM),從圖中可以看出,所制備的碳量子點呈類球形結(jié)構(gòu),分散性好,且尺寸均一,平均尺寸4～5 nm左右。從高倍透射電鏡(插圖)圖可以看出,Zn-CQDs的晶格間距約為0.21 nm,對應(yīng)于石墨的(102)晶面[16]。Zn-CQDs的X射線衍射譜圖在2θ=23.2°處出現(xiàn)一個較寬的衍射峰(圖2C),歸為碳的特征衍射峰,說明Zn-CQDs具有一定的晶型結(jié)構(gòu)。

2.2 測定原理

由于Zn-CQDs表面含有大量的羧基和氨基基團(tuán),能與Cu2+通過靜電作用結(jié)合并附著于Zn-CQDs表面,當(dāng)Zn-CQDs處于激發(fā)態(tài)時,Cu2+直接從光激發(fā)碳量子點的導(dǎo)帶吸收電子并轉(zhuǎn)移至未占有電子能級的最低軌道上,從而導(dǎo)致激發(fā)態(tài)電子不能有效回到價帶,即發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而使Zn-CQDs熒光猝滅。向該猝滅體系中加入GSH時,由于GSH分子內(nèi)的巰基和羰基只與Cu2+結(jié)合形成螯合物,且結(jié)合鍵的強度大于靜電作用力的強度,因此Cu2+會逐漸從Zn-CQDs表面脫離[17],使得體系的熒光逐漸恢復(fù)(圖1)。

圖4 pH值對體系熒光強度的影響Fig.4 Effect of pH value on the fluorescence intensity of the system

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1pH值本實驗選用50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液作為緩沖體系,考察了緩沖溶液pH值的影響。在pH 2.0～8.0范圍內(nèi),不同緩沖溶液pH值對熒光猝滅及恢復(fù)體系熒光強度的影響見圖4。在熒光猝滅及恢復(fù)體系中,當(dāng)pH≤6.0時,熒光強度變化值隨pH值的增加不斷增加,當(dāng)pH>6.0后,熒光強度變化值逐漸變小,故本實驗選擇磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液的最佳反應(yīng)pH值為6.0。當(dāng)反應(yīng)體系定容至3.0 mL時,緩沖液用量為1.9 mL。

2.3.2反應(yīng)時間研究了反應(yīng)時間對熒光恢復(fù)體系的影響。在1～10 min范圍內(nèi)每隔1 min測定1次體系熒光強度變化值,發(fā)現(xiàn)體系熒光強度變化值在1～5 min內(nèi)逐漸增加,隨后趨于穩(wěn)定,故選擇5 min為最佳反應(yīng)時間。

2.4 猝滅體系對GSH的選擇性

2.5 猝滅體系對GSH的響應(yīng)

在優(yōu)化實驗條件下,考察了猝滅后的Zn-CQDs熒光恢復(fù)程度與GSH濃度之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)GSH濃度在0.05～80 μmol/L內(nèi)與Zn-CQDs熒光恢復(fù)率呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=0.053 6x+0.340 4,其中,y表示熒光恢復(fù)率(F-F0)/F0,x表示GSH的濃度,相關(guān)系數(shù)r2=0.996 4,檢出限達(dá)63 nmol/L(S/N=3),且GSH濃度的變化對Zn-CQDs+Cu2+的熒光光譜幾乎無影響。相比于GSH的其他檢測方法(表1),本方法通過熒光探針的“關(guān)-開”模式對GSH進(jìn)行選擇性識別,具有線性范圍寬、檢出限低的優(yōu)勢,靈敏度和檢測效率較高。

(續(xù)表1)

MethodSampleLinear rangeLODReferenceColorimetryA549 cells3.0～30 μmol/L-[7]FluorescenceTomatoes and cucumbers0.05～80 μmol/L63 nmol/LThis work

2.6 實際樣品分析

取西紅柿和黃瓜樣品,按上述方法各平行測定5次,得到西紅柿和黃瓜提取液中GSH的平均含量分別為5.3 μmol/L和6.1 μmol/L。對樣品進(jìn)行1.0、20.0 μmol/L兩個水平的加標(biāo)實驗,每個水平平行測定5次,得到加標(biāo)回收率為98.6%～101%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～3.1%(n=5),結(jié)果見表2。說明本方法具有良好的回收率和精密度。

表2 實際樣品中谷胱甘肽含量的測定結(jié)果(n=5)Table 2 Determination results of GSH in practical samples(n=5)

3 結(jié) 論

本研究制備了一種高穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率的水溶性鋅摻雜碳量子點(Zn-CQDs),利用Cu2+對碳量子點的光致電子轉(zhuǎn)移猝滅及GSH-Cu2+之間的螯合作用,建立了碳量子點熒光猝滅-恢復(fù)效應(yīng)測定谷胱甘肽的新方法,實現(xiàn)了對果蔬中谷胱甘肽的靈敏檢測。在最優(yōu)條件下,方法的線性范圍為0.05～80 μmol/L(r2=0.996 4),檢出限達(dá)63 nmol/L。該分析方法專屬性強、靈敏度高、操作簡便,檢測時間短,在谷胱甘肽的檢測方面具有較為廣闊的應(yīng)用前景。