水蒸氣蒸餾法與超臨界CO2萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜分析胡椒木精油成分

杜麗君，牛先前，林曉紅，鄭國華

(1.漳州城市職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建省熱帶作物科學(xué)研究所，福建 漳州 363001)

胡椒木(Zanthoxylumpiperitum‘Odorum’)為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物，其全株具濃烈胡椒香味，自身少有病蟲害(目前僅發(fā)現(xiàn)偶有炭疽病及蚜蟲)，且周邊植物也少有病蟲害。研究發(fā)現(xiàn)胡椒木葉片精油中含有肉桂酸甲酯、檸檬烯、α-蒎烯、松油醇、香茅醛、β-水芹烯、α-石竹烯等多種驅(qū)蟲、殺蟲、殺菌成分[1]。同時(shí)，諸多研究報(bào)道，花椒屬植物含有如生物堿[2-3]、類黃酮物質(zhì)[4-5]、不飽和脂肪酸酰胺[6]、萜類化合物[7]等多種生理活性物質(zhì)，具有抗菌抗病毒、驅(qū)蟲殺蟲、鎮(zhèn)痛止癢、抑制血小板凝集、抗癌等生理藥理功效[8]，在醫(yī)療保健、食品工業(yè)和日化產(chǎn)品[9]等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。因此，利用胡椒木次生代謝物的驅(qū)蟲抗菌及諸多有利于人體的藥理活性特點(diǎn)，研究綠色環(huán)保的植物農(nóng)藥來替代化學(xué)合成類農(nóng)藥是減少環(huán)境污染、降低生態(tài)壓力、營造更利于人類健康生態(tài)環(huán)境的可行之路。

目前，有關(guān)植物驅(qū)蟲抗菌活性物質(zhì)的研究，較深入且具有產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景的是花椒屬植物，但花椒、胡椒產(chǎn)量的95%以上為食品原料，且受栽培技術(shù)、種植區(qū)域限制，而胡椒木具有易栽培、速生、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，滿足產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的條件。本研究通過水蒸氣蒸餾(SD)法和超臨界CO2萃取(SC-CO2)法分別提取胡椒木葉片精油，利用GC-MS分析了其組成成分，并對(duì)比溶劑萃取法及抗氧化性檢測(cè)結(jié)果，重點(diǎn)探討了不同提取方法對(duì)提取成分中驅(qū)蟲抗菌活性物質(zhì)的影響，為胡椒木精油的分離、提取、組分研究及綠色環(huán)境友好型植物農(nóng)藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Varian Saturn 3900/2100)、HA 220-50-06 CO2超臨界萃取裝置(南通市華安超臨界有限公司)、LGJ-25C冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)。

胡椒木為2年生盆栽苗(株高50 cm、冠徑50 cm，購自福建省福州市繽紛花木市場(chǎng))，先在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院盆栽試驗(yàn)場(chǎng)培養(yǎng)45 d，于9月中旬采摘生長健壯、無病蟲危害的完整葉片，單蒸水沖洗，混勻、晾干后，凍干，微粉成直徑小于0.46 mm的粉末，準(zhǔn)確稱取20 g用自封袋分裝，置于-40 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 胡椒木精油提取方法

1.2.1水蒸氣蒸餾(SD)法參照《中華人民共和國藥典》[10]中揮發(fā)油的測(cè)定方法進(jìn)行精油的提取，取胡椒木葉片20 g，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的提取時(shí)間、NaCl濃度、料液比，以精油得率為考察值，確定最佳提取條件。

1.2.2超臨界CO2萃取(SC-CO2) 取胡椒木葉片20 g，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的萃取時(shí)間、萃取壓力、萃取溫度，以精油得率為考察值，確定最佳提取條件。

精油得率(%)=萃取精油質(zhì)量/鮮樣質(zhì)量×100%。

1.3 GC-MS條件與測(cè)定

精油樣品進(jìn)樣前處理：樣品經(jīng)干燥，石油醚(60～90°)稀釋20倍后過0.22 μm有機(jī)濾膜，取1.5 mL待測(cè)。

色譜條件：采用DB-5MS色譜柱(300 mm×0.25 mm×0.25 μm)，載氣：He(99.999%)，流速1 mL/min(恒流模式)，進(jìn)樣量10 μL。傳輸線溫度：280 ℃，進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保留5 min；以5 ℃/min升至260 ℃，保留2 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，阱溫220 ℃。在40～650 amu的質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，記錄總離子流色譜圖(TIC)，以質(zhì)譜鑒定各色譜峰的化學(xué)成分，峰面積歸一法確定其相對(duì)含量。

1.4 抗氧化活性測(cè)定

將所得精油配制成2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL的精油乙醇溶液，備用。

DPPH·自由基清除能力測(cè)定：參考Feresin G E等[11]的方法，以同濃度的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為對(duì)照。

還原力測(cè)定：參考邢思雷等[12]的方法，以同濃度的抗壞血酸(Vc)為對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL、DPS 7.05版軟件數(shù)據(jù)處理，SigmaPlot.v10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

表1 SD法正交試驗(yàn)因子水平表Table 1 Factor levels of orthogonal experiment design by steam distillation

表2 SC-CO2法正交試驗(yàn)因子水平表

2.1 兩種提取方法的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因子試驗(yàn)基礎(chǔ)上，SD法選擇提取時(shí)間、NaCl濃度、料液比，SC-CO2法選擇萃取時(shí)間、萃取壓力、萃取溫度分別進(jìn)行3因子3水平(33)正交試驗(yàn)(表1～2)，以精油得率為考察指標(biāo)，分別考察2種提取方法的最佳提取條件。結(jié)果表明：SD法的最佳提取條件為提取時(shí)間4 h，NaCl濃度0%，料液比1∶6，此條件下精油得率為0.561 1%(n=3),高于正交試驗(yàn)方案中的最高值(0.550 1%)；SC-CO2法最佳提取條件為萃取時(shí)間為2.5 h，萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為30 ℃，此時(shí)，精油得率為0.953 2%(n=3)高于正交試驗(yàn)方案中的最高值(0.892 8%)，表明對(duì)2種提取方法提取條件的優(yōu)化是有效的。

2.2 兩種提取方法的GC-MS分析與鑒定

SD法和SC-CO2法提取的胡椒木葉片精油總離子流圖見圖1。各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析及計(jì)算機(jī)譜庫檢索確認(rèn)。結(jié)果顯示，SD法提取精油中鑒定出34種化學(xué)成分，占總成分的92.28%，包括16種烯烴、5種醇、5種酯、2種醛、1種酸、1種酮和4種其他物質(zhì)。SC-CO2法提取精油中鑒定出34種化學(xué)成分，占總成分的99.77%，包括15種烯烴、5種醇、6種酯、1種醛、1種酸、1種酮和5種其他物質(zhì)。詳細(xì)化學(xué)成分及鑒定結(jié)果見表3。

No.Retentiontime/minCompoundMolecular formulaContent( %)SDSC-CO216.271m-Xylene(間二甲苯)C8H10<0.10.11±0.0328.506α-Pinene(α-蒎烯)C10H160.73±0.06<0.139.939β-Phellandrene(β-水芹烯)C10H160.65±0.050.1±0.02410.126β-Pinene(β-蒎烯)C10H160.25±0.031.21±0.21510.609β-Myrcene(β-月桂烯)C10H168.41±0.56-611.165α-Phellandrene(α-水芹烯)C10H160.29±0.06<0.1711.956Limonene(檸檬烯)C10H16-11.13±1.21812.166Styrene(苯乙烯)C8H843.25±7.85-912.984γ-Terpinene(γ-松油烯)C10H160.29±0.050.14±0.011013.886Terpinene(異松油烯)C10H160.67±0.070.15±0.011114.393Linalool(哩哪醇)C15H26O0.19±0.06<0.11215.146Methyl octanoate(辛酸甲酯)C9H18O20.56±0.090.20±0.011316.069Citronellal(香茅醛)C10H18O0.18±0.040.1±0.011417.2142-Cyclohexen-1-one,4-(1-methylethyl)(4-異丙基-2-環(huán)己基烯酮)C9H14O0.15±0.030.1±0.011517.546Myrtenol(桃金娘醛)C10H16O<0.1-1617.844Piperitol(薄荷醇)C10H20O0.10±0.010.12±0.011718.198Nonanoic acid-methyl ester(壬酸甲酯)C10H20O20.10±0.01<0.11818.945Linalyl acetate(乙酸芳樟酯)C12H20O2<0.10.12±0.011921.711α-Terpinene(α-松油烯)C10H160.72±0.030.30±0.012022.924Methyl cinnamate (順式肉桂酸甲酯)C10H10O230.33±0.5873.91±5.342123.686Caryophyllene(石竹烯)C5H240.73±0.011.74±0.142223.886β-Elemene(β-欖香烯)C5H240.10±0.010.23±0.012324.613α-Caryophyllene(α-石竹烯)C5H241.81±0.124.12±0.452425.241Germacrene(大根香葉烯)C15H28<0.10.14±0.012525.834Valencene(朱欒倍半萜)C15H24-0.11±0.012626.420β-Selienen(β-蛇床烯)C15H24<0.10.1±0.012726.900Cyclohexanemethanol(環(huán)己烯甲醇)C15H26O0.1±0.010.14±0.012827.183γ-Elemene(γ-欖香烯)C15H240.23±0.010.57±0.012927.761Caryophyllene oxide(石竹烯氧化物)C15H24O<0.1<0.13029.8814-Methoxycinnamic acid methyl ester(甲氧基肉桂酸)C11H12O3<0.10.20±0.013132.310δ-Cadinene(δ-杜松烯)C15H24<0.10.21±0.013233.793Methoxyphenamine(甲氧那明)C11H17NO<0.11.46±0.123336.014Manool(淚杉醇)C20H34O0.32±0.011.77±0.163438.617Phytol(葉綠醇)C20H40O<0.10.16±0.013539.986Mandelic acid methyl ester(扁桃酸甲酯)C9H10O30.56±0.050.31±0.013640.189Mandelic acid benzyl mandelate(扁桃酸苯酯)C15H14O3-0.19±0.013742.291Alkylamide(多烯酰胺)C10H15NO0.31±0.030.11±0.01

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2.3 兩種提取方法獲得精油的化學(xué)成分及相對(duì)含量差異

對(duì)比SD法與SC-CO2法提取精油的化學(xué)成分結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，兩種提取方法中相同的化合物包括13種烯烴、5種醇、4種酯、1種醛、1種酸、1種酮和3種其他物質(zhì)，共28種，其中，已被證實(shí)具有驅(qū)蟲抗菌活性的物質(zhì)有：α-蒎烯[13]、肉桂酸甲酯[14]可抑制多種病原菌的生長、繁殖，具良好的抗菌活性；香茅醛[15]、薄荷醇[16]對(duì)蚊蟲具有較理想的趨避和擊倒活性；石竹烯、α-石竹烯是驅(qū)避和毒殺蚊蟲的有效成分[17]。但28種相同物質(zhì)的含量均存在明顯差異，如順式肉桂酸甲酯在SC-CO2法提取液中的相對(duì)含量(73.91%)為SD法(30.33%)的2倍多；α-石竹烯在SC-CO2法提取液中含量(4.12%)為SD法(1.81%)的2倍多；β-蒎烯在SC-CO2法提取液中為1.21%，在SD法提取液中為0.25%；石竹烯在SC-CO2法提取液中為1.74%，而在SD法提取液中僅0.73%。產(chǎn)生差異的原因是：SD法提取精油過程中，在高溫水蒸氣的作用下，胡椒木精油中的β-蒎烯極可能被轉(zhuǎn)化為α-蒎烯和莰烯，也會(huì)在氧氣的作用下進(jìn)一步被氧化為β-蒎烯氧化物和少量的桃金娘醛[18]；β-蒎烯熱裂解可獲得β-月桂烯[19]；松油烯可由α-蒎烯通過催化劑合成，也可由松油醇在酸作用下脫水而成[20]。本研究在SD法提取的精油中檢出α-蒎烯(0.73%)、桃金娘醛(<0.01%)、β-月桂烯(8.41%)和相對(duì)含量較高的松油烯(包括α-松油烯、γ-松油烯和異松油烯)，對(duì)照SC-CO2法的檢測(cè)結(jié)果可見，SD法對(duì)具有驅(qū)蟲抗菌活性的物質(zhì)破壞較大。

除28種相同化合物外，SC-CO2法提取液中檢出大量檸檬烯(11.13%)，與溶劑萃取法提取胡椒木葉片精油[1]研究結(jié)果一致，而SD法中未檢出。其原因可能與本研究中SD法的提取條件有關(guān)，檸檬烯雖可用SD法提取，但其本身是一種化學(xué)性質(zhì)非常活潑的單萜，提取過程中的高溫可使檸檬烯自動(dòng)氧化成檸檬烯氧化物、香芹酮、香芹醇、檸檬烯二氫過氧化物等[21]一系列的氧化單環(huán)單萜。檸檬烯具有強(qiáng)大的抗菌活性，可抑制多種病原菌生長、繁殖[13]，其對(duì)蚊蟲及其他昆蟲也具有明顯的驅(qū)避及毒殺活性[22-23]。SD法檢出大量苯乙烯(43.25%)，SC-CO2法未檢出，但檢出大量順式肉桂酸甲酯(73.91%)，可能是采用SD法提取過程中肉桂酸甲酯受熱時(shí)脫羧基而生成苯乙烯。因此，從獲得精油的驅(qū)蟲抗菌活性而言，SC-CO2法優(yōu)于SD法。

綜上所述，SC-CO2法較SD法獲得的胡椒木葉片精油保留了更多的驅(qū)蟲抗菌活性物質(zhì)，是較理想的提取方法。

2.4 抗氧化活性測(cè)定

研究表明，花椒屬植物精油具有很強(qiáng)的清理DPPH·自由基的能力[24]。本研究中胡椒木葉片精油抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果表明，SC-CO2法與SD法所獲精油均具有清除DPPH·自由基的能力，且隨著提取精油濃度的增加清除能力呈增強(qiáng)趨勢(shì)，但SC-CO2法提取物的清除能力明顯優(yōu)于SD法(圖2A)。SC-CO2法提取精油清除DPPH·自由基能力在8 mg/mL時(shí)達(dá)到對(duì)照BHT抑制率的97.27%，而SD獲得的精油在20 mg/mL的抑制率僅為對(duì)照的14.27%。采用線性回歸計(jì)算得到SC-CO2法清除DPPH·自由基的IC50為3.173 3，而SD法無法計(jì)算。說明在保留胡椒木葉片精油中清除DPPH·自由基能力物質(zhì)的穩(wěn)定性方面，SC-CO2法優(yōu)于SD法。

兩種提取方法獲得精油的還原力具有差異，SC-CO2法提取精油的還原力隨精油濃度的增加呈增強(qiáng)趨勢(shì)，而SD法增加不顯著(圖2B)。SC-CO2法提取精油的還原力在20 mg/mL達(dá)到對(duì)照Vc的34.86%，而SD獲得的精油在20 mg/mL的還原力僅為對(duì)照的5.98%。說明，SC-CO2法對(duì)胡椒木中還原性物質(zhì)的保護(hù)較好，而SD法對(duì)這類物質(zhì)破壞較大。

無論在清除DPPH·自由基能力還是在還原性方面，SC-CO2法>溶劑萃取法[1]>SD法。說明SC-CO2法提取方法對(duì)胡椒木精油中酚類、萜類等還原性和抗氧化性物質(zhì)的保留或萃取效果要優(yōu)于SD法。

3 結(jié) 論

本文采用優(yōu)化的SC-CO2法和SD法提取了胡椒木葉片精油并采用GC-MS分析，結(jié)合獲得精油的抗氧化性測(cè)定，對(duì)兩種提取工藝的成分進(jìn)行了分析驗(yàn)證。結(jié)果顯示，胡椒木精油含有多種驅(qū)蟲、殺蟲、抗菌等生物活性物質(zhì)，但不同提取工藝的選擇對(duì)獲得胡椒木精油中活性成分具有一定差異，SC-CO2法對(duì)精油的天然成分破壞較少，保留了大量活性成分，且精油獲得量較高，而SD法在溫度控制、萃取溶劑等方面尚有較多缺陷，需進(jìn)一步優(yōu)化。另外，僅用精油獲得量作為考察指標(biāo)，具有一定的局限性。本文對(duì)開發(fā)以胡椒木為原料的綠色植物源農(nóng)藥提供了參考。