全二維氣相色譜在食品風味化學成分分析中的應用

肖 雪，吳惠勤，陳嘯天，郭鵬然，宋化燦，向章敏

(廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室,廣東 廣州 510070)

食品風味是人們對由食物或飲料產生的氣味、口味和刺激性之間相互作用或整體的感覺[1]，是評價食品品質特征的重要指標。研究食品風味，需了解風味物質的成分并進行分析，一些揮發(fā)性化合物已被證明是食品風味的重要貢獻者[2-5]。隨著感官組學、風味組學、代謝組學等研究方法的興起，通過對樣本成分及其相關屬性進行全面綜合的分析，判斷食品的揮發(fā)性成分與原料、來源及其生產過程的關系[2-3,5-7]，進而闡明感官活性化合物與人體嗅覺刺激的關系[8]，可對食品的營養(yǎng)價值、加工過程進行有效控制和評定。目前，食品風味化學成分的檢測方法有氣相色譜法(GC)[9]、氣相色譜/聞香器(GC/O)[10-11]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[12-13]等，但這些方法存在雜峰干擾、分離度不夠、峰容量小等缺點。近年來，全二維氣相色譜技術(GC×GC)的應用使食品風味成分分析有了新突破，將其與頂空分析技術(HS)、固相微萃取技術(SPME)、同時蒸餾萃取法(SDE)等結合，在香氣成分族分離和指紋識別[14]、目標揮發(fā)性化合物分析[15]和未知物鑒定[7]方面具廣闊的應用前景。

GC×GC在復雜化合物的色譜分離中具有可提供高峰容量、高靈敏度、高分辨率，并能產生結構化的二維輪廓圖，有助于化合物的鑒定等優(yōu)勢[7,14-20]，這主要得益于在全二維氣相色譜中樣品經兩次獨立的分離并在第一次分離運行的同時完成二維分離，能夠在相當短的時間內提供相當多成分信息[14]。1991年，Liu和Phillips首次報道了全二維氣相色譜技術(GC×GC)[21]，成為經典一維色譜一次很好的升級。使用GC×GC對樣品分離因至少基于其兩個具體的化學性質(如揮發(fā)性、極性或手性)，較好地增加了峰容量和分離能力，可使性質相似的化合物成功分離開來[22]。因此，全二維氣相色譜被廣泛應用于環(huán)境[23]、植物[24]、石油[25]等領域。向章敏等基于全二維氣相色譜解析了煙氣中的酸性[26]、堿性[27]和中性[28]化學成分，并建立了煙葉中多種揮發(fā)性香味成分[29]和生物堿成分[30]的快速檢測方法。Dimandja等[31]首次使用GC×GC結合氫火焰離子化檢測器(FID)對食品進行分析，開辟了GC×GC在食品領域的應用。隨后，更多的研究報道將GC×GC與質譜聯用應用于食品加工監(jiān)測[32-34]、食品新鮮度評估[35-36]、食品真實性評估[37-38]、食品污染評估[39-40]、食品檢測[41-42]等食品分析領域。

食品風味物質的分析通常采用一維氣相色譜(1D-GC)或氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用法，但由于某些食品風味成分組成和基質復雜，一維氣相色譜難以實現完全分離，而全二維氣相色譜通過將分離機理不同而又相互獨立的兩根色譜柱以正交方式組合，極大地提高了色譜的分離能力和分析速度，可滿足于食品風味物質復雜化學成分的二次分離。本文綜述了全二維氣相色譜技術在未經二次加工的食品(如水果、蔬菜和肉類)和經過二次加工的食品(如乳制品、飲品和調味品)中風味物質的分析方面的應用，旨在為食品風味化學成分的分析提供借鑒。

1 食用農產品

1.1 水 果

水果的風味來源于其所含糖類、蛋白質、油脂和維生素等基本的營養(yǎng)物質[43]。草莓的風味通常決定其品質，進而影響消費者的選擇，Williams等[4]采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合全二維氣相色譜/氫火焰檢測器(GC×GC/FID)分析了草莓揮發(fā)物，該方法將第一維手性柱和第二維極性柱(BPX50,50%苯基聚硅氧烷-硅氧烷)直接耦合，分離了草莓中部分具有手性結構的風味物質，發(fā)現2,5-二甲基-4-羥基-(2H)-呋喃-3-酮(DMHF)主要以(-)-對映體形式存在，芳樟醇主要以S-對映體形式存在。Samykanno等[44]利用全二維氣相色譜飛行時間質譜聯用儀(GC×GC-TOF MS)研究了澳大利亞生長的Albion和Juliette草莓的揮發(fā)性成分，解決了一維色譜難分離的問題，在這兩種草莓中共檢出94種化合物，其中20種化合物用一維色譜無法檢出。該研究發(fā)現Juliette糖/酸比和Albion的相比略大，且2,5-二甲基-4-羥基-(2H)-呋喃-3-酮(呋喃酮)僅在Juliette中檢出，2,5-二甲基-4-甲氧基-(2H)-呋喃-3-酮在Juliette中占比較大，這些很好地解釋了兩個草莓品種甜度上的差異。刺果番荔枝具有一種令人愉快、類似于奶油味的獨特香氣，Cheong等[45]采用HS-SPME結合GC×GC-TOF MS在刺果番荔枝中檢出135種化合物，其中21種酯、6種醇、3種萜烯、2種酸、2種酮、2種醛和1種芳香族被認為是影響刺果番荔枝風味的關鍵揮發(fā)性化合物。菠蘿是一種比較受歡迎的熱帶水果，Steingass等[46]采用HS-SPME/GC×GC-qMS對早期成熟、收獲后成熟、上貨架末期成熟以及完全成熟時收獲的空運菠蘿中的揮發(fā)性成分進行了比較，鑒定出酯、萜烯、醇、醛、2-酮、游離脂肪酸和各種γ-和δ-內酯等291種揮發(fā)性成分，并通過GC×GC獲得的結構化分離圖譜揭示了各種同系列的化合物類別及倍半萜聚類情況。

1.2 蔬 菜

番茄和洋蔥是加工食品中常用蔬菜，Koutidou等[47]采用GC-MS和GC×GC-TOF MS測定了在加熱處理番茄洋蔥泥過程中的氣味活性化合物，其中GC-MS僅鑒定出18種化合物，為了提高分離效果，解決共洗脫問題，改善一維色譜分離后未確定氣味活性化合物的鑒定情況，作者利用全二維氣相色譜進行分離，以Rxi-5-Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)為第一根柱，BPX-50(1.15 m×0.1 mm×0.1 μm)為第二根柱，共鑒定出27種化合物。甜椒具有辛辣味的口感和獨特的香氣，并富含抗氧化物質(如類胡蘿卜素和維生素C)，通?？芍苯邮秤没蛴糜谳o助調味[48-49]。Gogus等[50]采用微波輔助萃取/GC×GC-TOF MS在新鮮紅辣椒、傳統(tǒng)和工業(yè)制造辣椒醬中分離鑒定出15種醇、14種萜烯、13種醛、12種酮、7種脂肪酸、6種脂肪酸酯和6種褐變反應產物共79種化合物，并發(fā)現2-戊酮、3-己醇、乙酸、油酸和亞油酸在新鮮辣椒和辣椒醬均有檢出，而(E)-2-十一烯醛、法尼醇、2-十五碳炔-1-醇、亞麻酸和角鯊烯僅在新鮮辣椒中檢出。二氫-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、糠醛、糠醇、甲基糠醛、3-甲基-2(5H)-呋喃酮和5-羥甲基糠醛等褐變反應產物在傳統(tǒng)和工業(yè)制造的辣椒醬中均有檢出，且其濃度在工業(yè)制造中要高得多，工業(yè)制造辣椒醬中只檢出39種揮發(fā)物，傳統(tǒng)制造辣椒醬經微波輔助正己烷提取的揮發(fā)物數量最多(共64種)，而且在傳統(tǒng)制造的醬中才能觀察到許多具有令人愉快的香氣特征物質。

1.3 肉類食品

海鮮中揮發(fā)性物質的產生受物種來源、環(huán)境、成熟度、生物因素、加工條件等影響，而這些揮發(fā)性物質與其質量和安全水平密切相關[51]。Leduc等[52]利用動態(tài)頂空氣相色譜嗅覺裝置(DH-GC/O)以及全二維氣相色譜與嗅覺裝置和質譜聯用(GC×GC-MS/O)對儲存了1、4、15 d的石斑魚風味物質進行分析，以尋找新鮮或腐壞的標志性物質。結果在石斑魚中檢出144種揮發(fā)性化合物，其中硫代甲烷、噻吩、甲苯、丁酸乙酯、己醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、二甲基-三硫醚、辛醛、1-壬烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛和2個未知化合物被認為與其氣味相關，并確認噻吩、己醛、1-辛烯-3-酮、二甲基-三硫醚和1-壬烯-3-醇可作為石斑魚新鮮或腐敗的標志性物質。Jin等[53]通過GC×GC-TOF MS分析發(fā)現魷魚樣本中含有184種揮發(fā)性化合物，包括39種芳香烴、22種脂肪烴、21種酯、20種醛、19種醇、18種磺基化合物、17種含氮化合物、14種酮、6種酸、5種呋喃和3種酚;與GC-MS分析結果相比，有119種化合物為首次報道。由此可見，全二維色譜比一維色譜能提供更多海鮮中揮發(fā)性物質的檢測數據。烹飪過程中氨基酸和還原糖的曼德拉反應及油脂的熱降解是香氣揮發(fā)的主要原因[54]。Rochat等[7]將100 μm的聚二甲基硅氧烷固相微萃取纖維頭插入冷凝器中提取烹飪過程中產生的揮發(fā)物，再采用GC×GC-TOF MS分析鑒定了烤箱烘烤的牛肉香氣中的硫醇類、硫化物、噻吩和噻唑等含硫化合物，該文采用多元線性回歸模擬輔助峰的識別，但模擬的準確性在識別同分異構體方面仍不足，作者又將GC×GC-TOF MS和GC/O相結合，從而鑒別了烤牛肉過程中釋放氣體中的含硫組分，并確認了苯乙硫醇、異丙基苯硫酚、二苯硫醚、甲基糠基二硫、二苯二硫醚和二甲基二硫醚6種關鍵性物質。德州扒雞是中國有名的一種傳統(tǒng)美食，Duan等[55]以加速溶劑提取和溶劑輔助蒸發(fā)法(ASE-SAFE)從德州扒雞中提取揮發(fā)性成分，并采用全二維氣相色譜-高分辨率飛行時間質譜法(GC×GC/HR-TOF MS)和GC-qMS進行檢測，發(fā)現前者可鑒定出91種化合物，而后者僅識別44種。研究認為，德州扒雞主要氣味活性成分為羰基化合物(33.04%)，其中2-位烯醛類和2,4-二烯醛類是其最重要的氣味活性成分，但(E)-2-十一烯醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-2-十二烯醛、(E)-2-十一烯醛、(E,E)-2,4-己烯醛、庚二烯醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛6個具有極性而且不穩(wěn)定的2-位烯醛類或2,4-二烯醛類僅可通過GC×GC/HR-TOF MS鑒定，進一步說明了全二維氣相色譜在肉類食品風味物質方面的檢測優(yōu)勢。

2 加工食品

2.1 乳制品

乳制品中風味化學分析常因乳品的異質性而變得復雜，其所含脂類、蛋白質和碳水化合物會導致風味物質在采用一維色譜時難以分離，且部分風味化合物因樣品狀態(tài)而異。因此，與加熱或加工的乳制品相比，生乳品會顯示出的獨特氣味常由酯類物質決定，其中內酯和雜環(huán)化合物存在于熱處理和巴氏殺菌牛奶中。另外，發(fā)酵的特色乳制品(如奶酪和酸奶)由于水解而存在脂肪酸產物[56]。Adahchour等[57]以乙醚萃取酸奶中的風味物質，并用GC×GC-TOF MS檢測。結果顯示，甲硫基丙醛和葫蘆芭內酯需從復雜的乳制品提取物中得到分離和鑒定，但其共洗脫容易產生2-庚酮和2-壬酮2個主峰，而甲硫基丙醛(m/z104)和葫蘆芭內酯(m/z128)卻大量存在于共洗脫背景中，普通的一維GC-MS無法實現分離。而采用GC×GC-TOF MS檢測時，背景干擾顯著消除，兩種目標分析物的質譜清晰可見，并可在40～90 ng/g范圍內直接定量。同時，δ-和γ-內酯、醛類、醇類、酮類和酸類通過CP-Sil 5 CB × BPX-50組合柱實現了有效的分離，結構也得以確認。此外，對于C14～C18有機酸類，GC×GC也消除了一維色譜檢測微量成分時的拖尾現象，達到準確定性的目的。Yue等[58]采用固相微萃取/GC×GC-TOF MS研究牛奶中的揮發(fā)性物質，該方法不僅分離出傳統(tǒng)GC-MS共洗脫的52種化合物，還首次鑒定了包括脂肪族碳氫化合物(69種)、芳香族碳氫化合物(42種)、酮類(28種)、酯類(16種)、醛類(14種)、醇類(14種)、酸類(14種)、含氮化合物(9種)、醚類(8種)和磺基化合物(3種)共107種揮發(fā)物，其中5種主要的揮發(fā)物依次為己酸(193.57 ng/mL)、甲氧基苯基肟(114.83 ng/mL)、辛酸(109.38 ng/mL)、4,5-二甲基-1-己烯(101.48 ng/mL)和2-戊酮(99.74 ng/mL)，可為改善牛奶品質提供數據支撐。而高品質黃油類乳制品的典型風味取決于其原材料、細菌的代謝活性、加工工藝、存儲條件等[59]因素。Adahchour等[2]用HS-SPME提取黃油中的揮發(fā)物，并采用1D-GC和GC×GC/FID-TOF MS進行測定，鑒定了包括醛、2-烯醛、酮、脂肪酸和內酯在內的幾類化合物。經分析發(fā)現，熱處理黃油樣品后，呋喃衍生物、雜環(huán)化合物、吡咯和吡啶等只能在熱處理后的樣品中找到。由于分離和檢測性能問題，1D-GC不能對幾種含有m/z99和71離子峰的化合物進行鑒定，而這些化合物被GC×GC-TOF MS鑒定為δ-內酯。因此，GC×GC能夠對目標化合物進行更可靠的分析，能快速識別出更多的未知風味化合物。

2.2 飲 品

果汁是以水果為原料經過物理方法(如壓榨、離心、萃取等)得到的汁液產品，具有不同風味的果汁飲料受到廣大消費者的喜愛。Komura[60]通過采用GC×GC/FID在變質果汁中檢出β-甲基苯乙酮和β-甲基異丙基苯-8-醇等化合物，并確定其為飲料變質的標志性化合物。Mastello等[61]通過GC×GC/HR-TOF MS對存在于巴氏殺菌橙汁中的風味物質進行了鑒定，確認了4種醛(己醛、庚醛、辛醛和檸檬醛)、2種酯(丁酸乙酯和己酸甲酯)和4種單萜(α-蒎烯、D-苧烯、芳樟醇和α-松油醇)可作為果汁的風味特征物質。紅茶在我國深受廣大消費者喜愛，其所含酚類化合物和黃嘌呤是影響茶味道及顏色的主要成分，而揮發(fā)物不僅是確定其特有香氣的基礎，也提供了幾個其他特征信息，如品種、地理來源、貯藏和處理方式等。GC×GC-TOF MS 技術使得分析的茶葉香氣化合物數量提高了數倍，一定程度上彌補了一維氣相色譜分析的不足，為茶葉香氣組分的進一步研究奠定了技術基礎。 Magagna等[62]采用HS-SPME和多組分纖維取樣技術，利用自動化的工藝流程全面回收95%的關鍵氣味物質，并結合GC×GC-MS研究了紅茶揮發(fā)性組分的特征信息，檢出包括氣味劑以及工藝和植物學的示蹤劑等在內的123種化合物，再利用模式識別對二維圖譜數據進行處理，可為紅茶質量評價提供豐富的化學信息。此外，利用GC×GC-TOF MS方法研究西湖龍井茶[63]、六堡茶[64]、綠茶[65]、鐵觀音[66]等茶葉中風味物質也有很多報道。

2.3 調味品

調味品是餐廳及家庭最常見的輔助調香用品，也越來越多的應用于保健品、化妝品和防腐劑中[67]。胡椒是被多樣化消費的品種，具有很高的經濟價值[68]，Cardeal等[69]采用GC×GC/FID、GC×GC-qMS和GC×GC-TOF MS分析了13種胡椒和胡椒粉樣品，以75 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)固相微萃取纖維頭進行HS-SPME前處理，再比較GC×GC/FID和GC×GC-qMS指紋圖譜信息。結果顯示，GC×GC-TOF MS比GC×GC-qMS檢出峰多約5倍，在巴西胡椒中，GC×GC-TOF MS可鑒別700多種化合物，而GC×GC-qMS僅鑒別出139種。鎮(zhèn)江香醋是我國受歡迎的傳統(tǒng)調味品，Zhou等[70]采用GC×GC-TOF MS和GC/O分析鎮(zhèn)江香醋中的芳香性氣味，并通過質譜匹配因子、結構信息和線性保留指數共確證了360種化合物，其中酮類物質最多，其次為酯類、醛類、醇類和呋喃類衍生物。將該結果與GC/O相應區(qū)域的氣味測定結果進行結合，確認甲硫醇、2-甲基-丙醛、2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛、辛醛、1-辛烯-3-酮、二甲基三硫化物、三甲基吡嗪、乙酸、3-(甲硫基)丙醛、糠醛、苯乙醛、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸和乙酸苯乙酯為鎮(zhèn)江香醋特征的風味成分，該研究表明從復雜基質中快速識別關鍵性氣味可通過GC×GC-TOF MS和GC/O的聯合使用來實現。香料一般是整株植物或植物的一部分，可以是新鮮或干燥的，整個的、切碎或磨碎的，由于其特有的顏色，香氣或風味，常被用于食物和飲料中以增強味道和吸引力。與新鮮香料相比，干香料在保存的過程中只有緩慢的質量損失，因此，人們更多地選擇干香料[71]。Maikhunthod等[72]將HS-SPME、GC/O與使用極性/非極性柱相組合的GC×GC/FID用以識別干茴香種子中的風味化合物，并將GC-O/FID數據與GC×GC-TOF MS分析保留指數相關聯，初步確認了檸檬烯、1,8-桉樹腦、松油烯-4-醇、草蒿腦和反式茴香腦為茴香芳香氣味的主要化合物。該文還測定了干茴香在半年到五年時間之內的風味物質變化，發(fā)現鼻腔沖擊頻率隨著時間的增加平均減少30%～50%，而代表“新鮮”的單萜烯(如β-蒎烯和β-月桂烯)，僅對半年的產品風味有影響，倍半萜烯和倍半萜氧化物的含量在5年內相應的增加，這被認為是一種老化的標志，另外，茴香醛氣味強度在不同保存時間內均保持不變。由此可見，全二維氣相色譜技術是追蹤風味變化過程的重要分析手段。

3 展 望

食品講究色、香、味、形，其中香與味是食品最重要的關鍵性指標之一。隨著國民經濟的發(fā)展以及人民生活水平的提高，越來越多的食品風味趨向多元化，人們更加喜歡香味濃郁、具有特殊風味的食品;同時食品存儲、加工、調配等過程中的也會產生風味變化，成分更加復雜，因此，關注食品風味特征化學成分的研究與分析將成為熱點。全二維氣相色譜具有分離能力強、峰容量大、選擇性高等特點，是一種非常適用于復雜樣品的色譜分離技術，尤其是在食品領域。本文闡述了GC×GC對幾種典型食品中揮發(fā)性風味成分的分離能力，該技術明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的1D-GC分離，能減少復雜基質的干擾，解決在1D-GC中共洗脫而被錯誤識別的情況。此外，越來越多的分析測試技術更趨向于樣品預處理與檢測儀器的完美結合，如頂空采樣模式(靜態(tài)頂空、動態(tài)頂空)、固相微萃取(SPME)、高分辨質譜等均可輕松地與GC×GC分析儀器能實現完美結合，更有利于這項目技術在食品的品質評價、產品定位、摻假鑒別、工藝控制等領域發(fā)揮作用。