嗎啡聯(lián)合厄洛替尼對肺腺癌裸鼠成瘤的抑制作用及機制

張雅靜，馬驂，梁歡，相成，張燕

厄洛替尼是一種特異性的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase Inhibitors，EGFR TKIs)，通過競爭性地抑制ATP與受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶活化，阻斷EGFR的傳導通路，從而達到治療腫瘤的目的。目前已廣泛應(yīng)用于EGFR敏感突變的晚期非小細胞肺癌患者的治療，不但使患者的中位生存時間明顯延長，且總體耐受良好[1-2]。嗎啡作為阿片類藥物的代表，廣泛應(yīng)用于癌痛的治療，極大地提高了腫瘤患者生活質(zhì)量。但有研究發(fā)現(xiàn)，阿片類藥物可能影響腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移[3-5]。因此，本文通過建立裸鼠成瘤模型進一步在體內(nèi)觀察嗎啡聯(lián)合厄洛替尼對腫瘤細胞的影響，為其臨床安全應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物： SD雄性裸鼠，4周齡，體質(zhì)量(15±3)g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(冀)2013-1-003，于河北科技大學藥用分子實驗室無菌條件下分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水；裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機數(shù)字表法分為4組，對照組、嗎啡組、厄洛替尼組、嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組(聯(lián)合組)，每組6只。

1.1.2 試劑及藥物： 人非小細胞肺癌細胞(HCC827)(中科院細胞庫),RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，TUNEL檢測試劑盒(Millipore)，BAX (Abcam，ab53154)、Caspase-3(Abcam，ab1384)、Bcl-2(Abcam，ab59348)，厄洛替尼(上海羅氏制藥有限公司)，鹽酸嗎啡片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)。

1.2 裸鼠成瘤模型構(gòu)建 2017年2—8月于河北科技大學藥用分子實驗室進行實驗。

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理： 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC827細胞，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2+95%空氣孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.2.2 皮下成瘤： 取對數(shù)生長期HCC827細胞，經(jīng)胰酶消化后制成5×107/ml的單細胞懸液，于各組鼠前腋皮下注射200 μl。對照組每日胃飼生理鹽水 5 ml/d，嗎啡組胃飼含嗎啡(20 mg/kg)生理鹽水5 ml/d，厄洛替尼組胃飼含厄洛替尼(5 mg/kg)生理鹽水5 ml/d，嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組胃飼含嗎啡(20 mg/kg)和厄洛替尼(5 mg/kg)生理鹽水 5 ml/d。實驗中裸鼠自由攝食飲水。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 腫瘤體積計算： 每周測量瘤體長徑(a)和瘤體短徑(b)，并計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=ab2/2。

1.3.2 腫瘤細胞凋亡檢測： 實驗3周后處死裸鼠，分離新鮮腫瘤組織，部分用于磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml，使用預先配制好的1×Binding Buffer 100 μl重懸細胞，按組別加入FITC Annexin Ⅴ 5 μl和PI染料5 μl震蕩混勻，室溫避光孵育15 min后加入1×Binding Buffer 400 μl混勻，流式細胞儀(FITC Annexin Ⅴ/PI雙染法)檢測各組細胞凋亡情況。Annexin Ⅴ-FITC陽性PI陰性細胞，代表早期凋亡率；Annexin Ⅴ-FITC陽性PI陽性細胞，代表晚期凋亡率。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3.3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達檢測： 上述剩余腫瘤組織標本用眼科剪剪碎后加入大約5倍體積的組織裂解液，用玻璃研磨器將組織塊研碎，冰上裂解30 min，4℃低溫離心機高速離心(13 000 r/min 20 min)，提取上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒進行蛋白定量后行Western blot實驗：抗Bax(1∶1 000)、Bcl 2(1∶500)、Caspase-3(1∶300)和抗GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，每次20 min，加入HRP標記的IgG(TTBS按1: 10 000稀釋)，37℃孵育1 h。TTBS避光洗膜3次，每次25 min，將ECL試劑盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，反應(yīng)1 min后對Western blot條帶進行顯影，以目的條帶和GAPDH條帶的光密度值比值作為最終結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤體積比較 對照組腫瘤生長迅速，隨時間延長腫瘤體積明顯增大；嗎啡組腫瘤生長緩慢，體積相對減小，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.063)；厄洛替尼組及聯(lián)合組腫瘤生長更為緩慢，裸鼠腫瘤體積均明顯縮小，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；與厄洛替尼組比較，聯(lián)合組變化不明顯(P=0.701)，見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.01

2.2 腫瘤細胞凋亡率比較 各組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=126.287，P<0.01)。與對照組(11.77±0.71)%比較，嗎啡組腫瘤細胞凋亡率(13.87±1.97)%雖有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)，厄洛替尼組(35.73±2.78)%和聯(lián)合組腫瘤細胞凋亡率(37.17±2.39)%較對照組明顯增多 (t/P=20.455/<0.001,t/P=24.954/<0.001)；而厄洛替尼組與聯(lián)合組腫瘤細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.969,P=0.353)，見圖2、3。

圖2 FITC AnnexinⅤ/PI雙染法流式細胞術(shù)各組細胞凋亡圖

注:與對照組比較，aP<0.05

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達比較 各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=101.555、161.308、96.757，P<0.001)。與對照組比較，嗎啡組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，厄洛替尼組和聯(lián)合組Bcl-2表達減少，Bax和Caspase-3表達增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；厄洛替尼組與聯(lián)合組比較，Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4、5。

圖4 各組凋亡相關(guān)蛋白的電泳圖

注：與對照組比較，P<0.001

3 討 論

隨著精準醫(yī)學概念的提出，EGFR基因突變的發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI類藥物如厄洛替尼的研發(fā)及臨床應(yīng)用，為亞裔尤其是中國攜帶EGFR敏感突變的肺癌患者帶來了更長生存時間和更好的生活質(zhì)量[1-2]。肺癌目前居惡性腫瘤發(fā)病和死亡首位，5年生存率依然差強人意[6-7]。隨著病情進展，大部分患者都會經(jīng)歷癌痛的折磨，嚴重影響患者的治療和生活質(zhì)量。依據(jù)“三階梯止痛”原則，嗎啡已被廣泛用于腫瘤患者癌痛的治療。但迄今為止，嗎啡等阿片類藥物與腫瘤細胞增殖和凋亡的具體機制仍不清楚[3-5，8]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在細胞學水平嗎啡、厄洛替尼以及嗎啡聯(lián)合厄洛替尼作用于HCC827細胞后，均可引起HCC827細胞凋亡率增加[9]。在前期實驗的基礎(chǔ)上通過建立HCC827肺腺癌細胞裸鼠成瘤模型深入地研究嗎啡聯(lián)合厄洛替尼對腫瘤細胞的影響及其機制。

研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡組腫瘤生長稍緩慢，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。厄洛替尼組及嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組腫瘤生長更為緩慢，與對照組比較腫瘤體積明顯縮小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與厄洛替尼組相比嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組腫瘤體積無明顯差別。該結(jié)果表明嗎啡聯(lián)合厄洛替尼時，嗎啡并未影響厄洛替尼抗腫瘤及延緩腫瘤生長的作用。

凋亡作為細胞程序性細胞死亡方式，在維持機體細胞新生及代謝平衡方面起著至關(guān)重要的作用[10-11]。為進一步研究動物水平嗎啡聯(lián)合厄洛替尼抗腫瘤機制，進一步應(yīng)用流式細胞學技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測了細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達。既往研究表明Bcl-2屬于原癌基因家族，可通過抑制Caspase-3的表達發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)[12]；敲除Bcl-2家族成員Bim可以引起內(nèi)源性藥物抵抗或者降低腫瘤細胞EGFR-TKIs的敏感性而產(chǎn)生耐藥[13]，Bax基因下調(diào)亦會導致厄洛替尼誘導細胞凋亡效應(yīng)減弱[14-17]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)嗎啡作用于HCC827細胞可引起細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的變化[16]。

與對照組比較，嗎啡組細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，差異無統(tǒng)計學意義，與前期細胞水平結(jié)果不相一致[18]。其原因分析可能與體內(nèi)體外試驗因素有關(guān)，亦可能與嗎啡濃度有關(guān)。劉紅軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡呈濃度依賴性的促進MADB-106乳腺癌細胞的凋亡。厄洛替尼組及嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組細胞凋亡率明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與厄洛替尼組比較，嗎啡聯(lián)合厄洛替尼組在細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達無明顯差別(P>0.05)。進一步說明厄洛替尼或嗎啡聯(lián)合厄洛替尼應(yīng)用時可通過線粒體通路誘導細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

嗎啡在緩解疼痛的同時并不會消弱厄洛替尼的抗腫瘤作用，本研究為嗎啡聯(lián)合厄洛替尼治療晚期非小細胞肺癌患者生活質(zhì)量的提升提供了理論基礎(chǔ)，為嗎啡和厄洛替尼的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

張雅靜：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;馬驂：提出研究思路，分析實驗數(shù)據(jù);梁歡：實施研究過程，數(shù)據(jù)收集整理;相成：進行統(tǒng)計學分析;張燕：論文終審