TBX18腺病毒使成鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的研究

李艷君，唐艷紅，陳元秀，楊媚

干細(xì)胞特指具有自我更新和分化能力的細(xì)胞集，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方法在過(guò)去15年獲得了廣泛關(guān)注[1]。骨髓腔由造血細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞等多相細(xì)胞群組成，其中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是多能干細(xì)胞，可以在體內(nèi)和體外分化成多種細(xì)胞類型，且較易從骨髓中獲取，并進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增[2-4]。T-BOX轉(zhuǎn)錄因子在胚胎期心臟細(xì)胞特異性的形成過(guò)程中起重要作用，已有研究證實(shí)，TBX18轉(zhuǎn)錄因子能誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞分化為起搏樣細(xì)胞，并特異性表達(dá)起搏細(xì)胞的特有標(biāo)志物[5]。但是TBX18能否誘使成鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為心肌樣細(xì)胞，仍未可知。本文旨在研究TBX18轉(zhuǎn)錄因子能否成功轉(zhuǎn)入BMSCs，并誘導(dǎo)其向心肌樣細(xì)胞分化，以期更好地指導(dǎo)臨床，報(bào)道如下。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)于2015年5月—2016年10月在武漢大學(xué)心血管病研究所/心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 成年SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量160～200 g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2014-0004]。

1.1.2 試劑： 胎牛血清(FBS)、低糖DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)基(Gibco公司)，兔抗α-SMA單克隆抗體、鼠抗cTnI單克隆抗體(Abcam公司)，重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP-TBX18 和pHBAd-MCMV-GFP(上海漢恒生物科技有限公司)，Alexa Fluor 647共軛的倉(cāng)鼠抗大鼠CD29抗體、PE-Cy7共軛的小鼠抗大鼠CD90抗體、FITC共軛的小鼠抗大鼠CD45抗體、Alexa Fluor 647共軛的倉(cāng)鼠IgM同型抗體、PE-Cy7共軛的小鼠IgG1同型抗體、FITC共軛的小鼠IgG1同型抗體(美國(guó)BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定: 將大鼠麻醉，脫頸處死，用75%酒精浸泡5～10 min；于無(wú)菌操作臺(tái)中取出股骨和脛骨，PBS加2%雙抗清洗3～5次，盡量去除表面附著的軟組織。剪掉兩端干骺端，暴露骨髓腔，用5 ml注射器吸取10 %L-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白為止。將收集的懸液接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，再轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO2培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中。48 h后首次換液，以后每2～3 d換一次液，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～85%時(shí)，用0.25 %胰酶(不含EDTA)進(jìn)行消化傳代。取第3～5代細(xì)胞制成1×105/L 的細(xì)胞懸液，分別加入Alexa Fluor 647共軛的倉(cāng)鼠抗大鼠CD29抗體、PE-Cy7TM共軛的小鼠抗大鼠CD90抗體、FITC共軛的小鼠抗大鼠CD45抗體，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的同型陰性對(duì)照組，即Alexa Fluor 647共軛的倉(cāng)鼠IgM同型抗體、PE-Cy7TM共軛的小鼠IgG1同型抗體、FITC共軛的小鼠IgG1同型抗體，流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)志物及純度，隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組(TBX18組)、空白病毒對(duì)照組(GFP組)和空白對(duì)照組(B組)。

1.2.2 人TBX18(hTBX18)腺病毒載體的構(gòu)建及擴(kuò)增： BamHI和NotI雙酶切回收腺病毒骨架載體pHBAd-MCMV-GFP，PCR擴(kuò)增TBX18 ORF序列，將處理好的目的片段與載體連接，得到重組腺病毒質(zhì)粒pHBAd-MCMV-GFP-TBX18。將pHBAd-MCMV-GFP-TBX18轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌株，將轉(zhuǎn)化后的TBX18平板挑菌，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，用293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，直至獲得大量純化的TBX18腺病毒載體。

1.2.3 TBX18及GFP腺病毒的轉(zhuǎn)染： 取第3～5代BMSCs接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合至50%～70%時(shí)，按感染復(fù)數(shù)即MOI=20、50、80、100分別加入TBX18或GFP重組腺病毒載體，以不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基定容至1 ml，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后將病毒懸液吸出，再加入完全培養(yǎng)基2 ml，分別于 24 h及48 h后熒光顯微鏡下觀察，均以不引起明顯細(xì)胞病變效應(yīng)的最大MOI值為合適的感染復(fù)數(shù)。經(jīng)過(guò)不斷嘗試，確定本實(shí)驗(yàn)的最適MOI=100。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)α-SMA mRNA的表達(dá)： 轉(zhuǎn)病毒后1周，用Trizol試劑提取各組BMSCs的總量RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行熒光定量PCR (qRT-PCR)檢查，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，58 ℃退火20 s，最后72 ℃延伸20 s，共循環(huán)40次。引物序列：α-SMA：5′-GAGCACGGCATTATCACCAAC-3′，5′-CAGAACAATGCCTGT GGTTCTC-3′；GAPDH：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，5′-TTGCTGACAATC TTGAGGGA G-3′，以GAPDH作為內(nèi)參，用2-△△Ct法進(jìn)行定量分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)α-SMA和cTnI蛋白的表達(dá)： 轉(zhuǎn)病毒后1周，提取3組細(xì)胞的總蛋白，冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，12 000 g離心5 min，收集上清液，即為總蛋白溶液。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒來(lái)測(cè)定各孔蛋白濃度，每孔約加入蛋白40 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，兔抗α-SMA單克隆抗體(1∶3 000)、鼠抗cTnI單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，再加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)室溫下孵育30 min，TBST沖洗4次。用AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析相對(duì)應(yīng)的光密度值，以GAPDH為內(nèi)參作相對(duì)定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)特征及鑒定 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，呈圓形，大小不一；6～8 h后開始貼壁，呈圓形、多角形或梭形；48 h后細(xì)胞貼壁完成，呈三角形或梭形；7～10 d 形成細(xì)胞集落，呈均一的紡錘形；隨著傳代次數(shù)增加，雜細(xì)胞越來(lái)越少，骨髓干細(xì)胞越來(lái)越梭，同向排列，呈漩渦狀或放射狀。轉(zhuǎn)病毒后24 h 和48 h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染，TBX18組和GFP組因含綠色熒光蛋白而呈綠色，BMSCs轉(zhuǎn)染效率較高，可達(dá)95%～96%(圖1見(jiàn)封3)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明：培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29和CD90，幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45，表明通過(guò)此法獲得的細(xì)胞是較純凈的BMSCs(97%～99%)，見(jiàn)圖2。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)α-SMA mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后1周，檢測(cè)各組α-SMA mRNA的表達(dá)，結(jié)果提示：TBX18 組的α-SMA mRNA(2.66±0.08)表達(dá)水平明顯高于GFP組(1.49±0.09)和B組(1.00±0.00)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.743、36.813，P=0.000、0.000)，見(jiàn)圖3。

注：T.TBX18組；G.GFP組；B.B組。與G組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

2.3 Western blot檢測(cè)α-SMA和cTnI蛋白的表達(dá) Western blot法檢測(cè)各組相對(duì)光密度值結(jié)果顯示：TBX18 組α-SMA蛋白的表達(dá)(0.66±0.00)明顯高于GFP組(0.36±0.08)和B組(0.17±0.03)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.751、23.761、P=0.003、0.000)；cTnI蛋白的表達(dá)(0.57±0.12)明顯高于GFP組(0.32±0.04)和B組(0.09±0.00)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.298、6.660、P=0.030、0.003)，見(jiàn)圖4。

注：T.BX18組；G.GFP組；B.B組。與G組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

3 討 論

BMSCs是骨髓中的非造血干細(xì)胞，在治療心血管疾病時(shí)，BMSCs是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的再生療法的首選供體，因?yàn)檫@類細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢(shì)，包括易獲得，便于增殖，低免疫原性，易于導(dǎo)入外源基因和進(jìn)行基因修飾等[6-8]。盡管目前可選的方法有很多，但移植干細(xì)胞直接分化成為心肌細(xì)胞，仍然是心臟再生治療的一大挑戰(zhàn)。突出強(qiáng)調(diào)研究這個(gè)至關(guān)重要的細(xì)胞分化過(guò)程和研發(fā)新的改善心臟再生治療方案的重要性和緊迫性[9-10]。

盡管對(duì)BMSCs的生物化學(xué)特征和免疫組織化學(xué)特征進(jìn)行了眾多研究，仍然沒(méi)有重要的參數(shù)來(lái)鑒別和描述這些干細(xì)胞[11-13]。從理論上來(lái)講，這些參數(shù)應(yīng)包括細(xì)胞增殖速度、免疫表型標(biāo)志物、細(xì)胞活性和表型細(xì)微結(jié)構(gòu)等[14]。體外用于鑒別BMSCs的方法，多采用分析細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，如CD90、CD29、CD44和CD106，其中應(yīng)用較多的當(dāng)屬CD29及CD90[15]。經(jīng)研究證實(shí)，CD90和CD29是干細(xì)胞的典型標(biāo)志物，CD45是淋巴造血細(xì)胞的表面標(biāo)志物。在本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs 的表面標(biāo)志物CD90和CD29的陽(yáng)性率為97%～99%，幾乎看不到CD45的表達(dá)，由此足以說(shuō)明，全骨髓貼壁法可分離獲得較為純凈的BMSCs。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

TBX18是轉(zhuǎn)錄因子 T-box 家族中的一員，位于染色體6q14-q15，是新的祖細(xì)胞標(biāo)志因子之一，也是胚胎發(fā)育期的重要轉(zhuǎn)錄因子[16-17]。TBX18在心包膜、心外膜、間充質(zhì)祖細(xì)胞、竇靜脈區(qū)的分化心肌細(xì)胞中表達(dá)，可形成竇角和竇房結(jié)心肌細(xì)胞，但不形成心房和肺靜脈心肌細(xì)胞[18]。經(jīng)研究證實(shí)，TBX18陽(yáng)性的心外膜細(xì)胞可形成室間隔和左心室心肌細(xì)胞[19]。以TBX18為基礎(chǔ)的基因家族分析也表明，心外膜細(xì)胞直接形成心臟的成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞系[20-21]。那么單一的轉(zhuǎn)錄因子TBX18能否使BMSCs分化為心肌細(xì)胞呢？基于此，本文構(gòu)建了TBX18腺病毒載體，轉(zhuǎn)染成年大鼠BMSCs，經(jīng)過(guò)不斷測(cè)試，確定最佳MOI=100，此時(shí)熒光表達(dá)較亮，轉(zhuǎn)染效率高，死細(xì)胞少，且將此滴度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，病毒轉(zhuǎn)染后再繼續(xù)培養(yǎng)1周，用分子生物學(xué)方法檢測(cè)心肌相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，即α-SMA和cTnI的表達(dá)。

Ca2+通過(guò)2種特有的調(diào)節(jié)蛋白，即肌鈣蛋白和原肌球蛋白，以調(diào)控椎橫紋肌的肌動(dòng)蛋白(Tn)及肌球蛋白(Tm)的收縮，Tn和Tm均位于細(xì)肌絲[22]。其中，Tn由3個(gè)亞基組成，即肌鈣蛋白C(TnC)，肌鈣蛋白T(TnT)和肌鈣蛋白I(TnI)，cTnI在心臟中具有較高的特異性，且參與調(diào)控肌肉收縮，主要分布于骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中，幾乎不存在于平滑肌細(xì)胞，因此，cTnI是鑒別心肌細(xì)胞的特有蛋白[23]。α-SMA常被用作鑒別心肌細(xì)胞，兔抗α-SMA單克隆抗體是專門用來(lái)鑒別α-骨骼肌和α-心肌輔肌動(dòng)蛋白，誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞具有心臟肌小節(jié)，與α-SMA抗體起作用[24]。本結(jié)果提示：TBX18轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BMSCs形成的細(xì)胞，可表達(dá)心肌細(xì)胞的特有標(biāo)志物，即α-SMA和cTnI，表明單一的轉(zhuǎn)錄因子TBX18能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞。此結(jié)果是可喜的，但轉(zhuǎn)化率依然不是很高，如何高效地誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，依然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題[25-26]。那么TBX18轉(zhuǎn)錄因子能否使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為起搏樣細(xì)胞呢？這也為我們下一步的研究方向提供了新的思路。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

李艷君：負(fù)責(zé)實(shí)施研究過(guò)程，撰寫論文；唐艷紅、陳元秀：論文修改、審核；楊媚：提出研究思路，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過(guò)程