黃芪甲苷對(duì)肥胖糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激、Nrf2蛋白表達(dá)和胰島β細(xì)胞的影響

劉文，章尹崗，別志霞，解為慈，葉迎春

糖尿病(DM)是以高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征，糖尿病腎病(DN)是其常見慢性并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及高血糖、氧化應(yīng)激等多種因素，其中氧化應(yīng)激是關(guān)鍵因素之一，其產(chǎn)生的過量活性氧(ROS)可激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，介導(dǎo)高糖對(duì)腎組織的損傷[1-2]。有研究指出[3]，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf 2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者。黃芪甲苷(AS-IV)是從傳統(tǒng)中藥黃芪中提取分離主要活性成分皂苷的有效單體成分，在臨床試驗(yàn)研究中證實(shí)其具有抗炎、抗纖維化、抗糖尿病、抗氧化應(yīng)激、心臟保護(hù)等多種藥理作用[4]。有研究報(bào)道[5]，AS-IV可降低DM大鼠血糖水平，發(fā)揮抗氧化作用，減輕心肌損傷。但關(guān)于AS-IV對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響鮮有報(bào)道。本研究建立肥胖DM大鼠模型，觀察AS-IV對(duì)大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及對(duì)腎臟Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響，旨在進(jìn)一步了解AS-IV對(duì)DM大鼠腎臟損傷的防止作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性Wistar大鼠25只，購(gòu)于重慶騰鑫華阜公司，周齡6～8周，實(shí)驗(yàn)前為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，日常光照，自然飲水。(2)主要試劑 ： STZ(鏈脲佐菌素，美國(guó)Sigma公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(美國(guó)Omega公司)，總蛋白、核蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)，兔抗Nrf 2多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH單克隆抗體(美國(guó)CST公司)。(3)儀器設(shè)備：血糖分析儀(德國(guó)羅氏公司)、BH-2型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、UVP分析儀(美國(guó) BioSpec公司)。

1.2 模型建立與分組 2018年1—6月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字表法選取8只作為對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)(碳水化合物65%，蛋白質(zhì)25%，脂肪10%)；另外17只高脂飼料喂養(yǎng)(脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白質(zhì)20%)，喂養(yǎng)2周后，給予STZ 60 mg/kg一次性單劑量腹腔注射，建立DM大鼠模型，注射72 h后鼠尾靜脈取血測(cè)血糖，將非禁食血糖>16.7 mmol/L，且能維持1周作為評(píng)價(jià)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，僅1只大鼠造模失敗，16只大鼠造模成功。再按隨機(jī)數(shù)字表法分為DM組及AS-IV組，各8只。AS-IV組給予80 mg·kg-1·d-1AS-IV灌胃給藥，對(duì)照組和DM組給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。連續(xù)給藥8周。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 標(biāo)本收集： 給藥8周后處死大鼠，處死前將大鼠放入代謝籠，留取24 h尿液并記錄尿量，而后給予5%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清低溫-80℃冰箱保存；并于麻醉后剖腹取其腎臟，濾紙吸干血跡稱質(zhì)量備用。部分腎皮質(zhì)使用4%中性甲醛固定，石蠟包埋制片，行蘇木精—伊紅(HE)染色；剩余部分迅速放于液氮凍存，行Western免疫印跡試驗(yàn)。

1.3.2 血、尿相關(guān)指標(biāo)及體質(zhì)量測(cè)定： 采用血糖分析儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)，放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素(FINS)，使用雙抗體夾心法檢測(cè)24h尿白蛋白排泄率(UAER)，并測(cè)定大鼠體質(zhì)量。

1.3.3 腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)： 上述腎臟組織生理鹽水沖洗干凈，剪碎后加入適量裂解液搖勻，采用南京建成生物公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)MDA、總超氧化物歧化酶(T-SOD)水平，嚴(yán)格按照說明書操作。

表1 各組大鼠血、尿相關(guān)指標(biāo)及體質(zhì)量比較

1.3.4 胰島細(xì)胞病理改變觀察： 大鼠胰尾組織常規(guī)固定、切片(厚度2 μm)，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察胰島細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)變化。胰島細(xì)胞凋亡：石蠟切片后，采用原味末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率(凋亡細(xì)胞核數(shù)目/總細(xì)胞核數(shù)目×100%)，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.5 Western免疫印跡檢測(cè)Nrf 2蛋白： 取液氮凍存的腎皮質(zhì)，充分研磨、裂解、離心，4℃ 1 200 r/min離心10 min，取上清液提取總蛋白，制膠，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉，加入兔抗Nrf 2多克隆抗體(1∶800)及GAPDH標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參(1∶1 000)，4℃孵育過夜后，加入相應(yīng)的二抗，室溫下孵育1 h，加ECL顯色，使用美國(guó)UVP分析儀掃描膠片，得到灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 血、尿相關(guān)指標(biāo)及體質(zhì)量比較 DM組及AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組，F(xiàn)INS顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質(zhì)量顯著低于DM組，F(xiàn)INS顯著高于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 DM組及AS-IV組大鼠MDA含量顯著高于對(duì)照組，T-SOD活性顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AS-IV組大鼠MDA含量顯著低于DM組，T-SOD活性顯著高于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3 胰島細(xì)胞病理改變比較 對(duì)照組大鼠胰島輪廓清晰，胰島細(xì)胞數(shù)目較多且大小一致、排列整齊；DM組大鼠胰島輪廓不清，胰島細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著減少，且出現(xiàn)腫脹、壞死及空泡變性，呈不規(guī)則排列；AS-IV組大鼠胰島輪廓較為清晰，胰島細(xì)胞數(shù)目較DM組有所增多，形態(tài)、排列較為規(guī)則，無明顯壞死(圖1見封3)。

表2 各組大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 胰島細(xì)胞凋亡情況比較 光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡的胰島細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，呈棕黃色，而未凋亡的細(xì)胞核染色質(zhì)呈藍(lán)色。TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組棕黃色細(xì)胞核數(shù)目較少，DM組棕黃色細(xì)胞核數(shù)目較對(duì)照組顯著增多，AS-IV組棕黃色細(xì)胞核數(shù)目較DM組有所減少(圖2見封3)。DM組及AS-IV組大鼠胰島細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(t=9.991、5.987，P=0.000)，AS-IV組大鼠胰島細(xì)胞凋亡率顯著低于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.952，P=0.000)，見圖3。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與DM組比較，bP<0.01

2.5 Nrf 2蛋白表達(dá) 免疫印跡結(jié)果顯示，DM組大鼠腎組織總Nrf 2、核Nrf 2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組及AS-IV組(t=2.542、3.881、2.642、2.267，P=0.024、0.002、0.019、0.040)，AS-IV組大鼠腎組織總Nrf 2、核Nrf 2蛋白表達(dá)顯著高于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.985、2.928，P=0.010、0.011)，見圖4、5。

圖4 各組大鼠腎組織總Nrf2、核Nrf2蛋白表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05

3 討 論

DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前多認(rèn)為是在遺傳基礎(chǔ)上多因素共同作用的結(jié)果。近年來，多項(xiàng)研究提示氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS是引起DM發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，關(guān)于氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究現(xiàn)已成為熱點(diǎn)領(lǐng)域[6]。DM患者腎臟易受氧化應(yīng)激反應(yīng)影響，損傷腎組織細(xì)胞，破壞基質(zhì)重構(gòu)，導(dǎo)致組織纖維化及信號(hào)通路異常，從而促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展，加重腎臟損傷。機(jī)體內(nèi)過多的ROS可攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物，干擾機(jī)體新陳代謝[7-8]。T-SOD是具有抗氧化作用的小分子肽類物質(zhì)。本研究中DM組及AS-IV組大鼠MDA含量顯著高于對(duì)照組，T-SOD活性顯著低于對(duì)照組，AS-IV組大鼠MDA含量顯著低于DM組，T-SOD活性顯著低于DM組，提示高脂飲食可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)大量ROS蓄積，營(yíng)養(yǎng)過剩從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而給予AS-IV治療可有效改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕腎臟損傷，與韓冬[9]研究類似。

AS-IV是以黃芪為原料的黃芪皂苷類單體成分，經(jīng)藥理研究證實(shí)對(duì)人體多臟器、多系統(tǒng)具有較好的保護(hù)作用，抗炎、降壓、改善心肌缺血等方面作用顯著[10-11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在治療糖尿病的處方中，黃芪使用率極高，從黃芪根中分離的多糖(APS-G)可雙向調(diào)節(jié)血糖，降低葡萄糖負(fù)荷的小鼠血糖水平，改善抗腎上腺素導(dǎo)致的小鼠血糖升高反應(yīng)[12]。涂祎珺等[13]研究報(bào)道，黃芪可有效提高血漿白蛋白水平，降低尿蛋白排出量，提供機(jī)體必需氨基酸，顯著改善腎小球疾病導(dǎo)致的代謝紊亂，同時(shí)黃芪強(qiáng)大的降脂效果還可以防治腎小球硬化。肖峰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可有效抑制DM大鼠早期腎/體質(zhì)量增加，降低大鼠高血糖。尚偉慶[15]采用中西醫(yī)結(jié)合方法治療腎病綜合征患者的研究提示，黃芪可提高血漿白蛋白水平，降低24h尿蛋白定量，且AS-IV可促進(jìn)H3亮氨酸合成肝臟蛋白，加速蛋白質(zhì)合成。本研究DM組及AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組，F(xiàn)INS顯著低于對(duì)照組，AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質(zhì)量顯著低于DM組，F(xiàn)INS顯著高于DM組，與上述研究較為一致，認(rèn)為AS-IV可有效改善DM大鼠血糖，減輕體質(zhì)量，降低尿白蛋白排泄量，改善腎小球肥大及基質(zhì)增生，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

Nrf2是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因子，正常情況下，可在機(jī)體各組織及細(xì)胞中表達(dá)，與Kelch樣環(huán)氧丙烷相關(guān)蛋1(Keap1)結(jié)合形成二聚體在胞漿中存在，最后被泛素化降解，僅小部分穩(wěn)定Nrf2可經(jīng)磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。并與ARE作用激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2下游靶基因(抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因)維持在基礎(chǔ)表達(dá)水平，細(xì)胞趨于穩(wěn)定狀態(tài)。但氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的ROS可使Nrf2磷酸化并與Keap1解離，轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，激活Nrf2下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Peng等[16]動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)敲除大鼠Nrf2基因的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生率更高，Nrf2基因缺失或激活障礙的大鼠氧化應(yīng)激源細(xì)胞毒性更強(qiáng)，分析其原因?qū)W者們認(rèn)為與慢性炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)。因而，可認(rèn)為Nrf2-ARE通路對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)及凋亡過程中具有較好的保護(hù)作用。

本研究Western免疫印跡結(jié)果顯示，DM組、AS-IV組大鼠腎組織總Nrf2、核Nrf2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，AS-IV組大鼠腎組織總Nrf2、核Nrf2蛋白表達(dá)顯著高于DM組，與前面提到的Nrf2-ARE通路的抗氧化應(yīng)激、抗炎性反應(yīng)作用相符。Vento等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ROS表達(dá)上調(diào)并超過Nrf2的抗氧化能力后，可提高Nrf2降解作用，降低Nrf2活性，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。基于此，筆者認(rèn)為本研究DM組大鼠總Nrf2、核Nrf2蛋白低表達(dá)的原因可能是由于高糖高脂飲食下，ROS過多生成并蓄積，直接抑制Nrf2，導(dǎo)致其胞漿泛素化降解程度增加，入核減少，總蛋白、核蛋白均為低表達(dá)。而胰島β細(xì)胞抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因均為低表達(dá)，抗氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)作用較差[18-20]，DM組Nrf2蛋白低表達(dá)，可進(jìn)一步減弱抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)，從而加重胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及炎性反應(yīng)損傷。而AS-IV組總Nrf2、核Nrf2蛋白表達(dá)顯著高于DM組，提示應(yīng)用黃芪甲苷可激活Nrf2-ARE通路，減輕Nrf2泛素化降解程度，穩(wěn)定其胞漿濃度，提高核轉(zhuǎn)移活性，并上調(diào)抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)，從而提高對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用，延緩胰島β細(xì)胞凋亡。

綜上所述，AS-IV有降低肥胖DM大鼠血糖、體質(zhì)量，減少尿蛋白排泄的作用，同時(shí)還能減輕大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，激活Nrf2-ARE通路，從而起到防止胰島β細(xì)胞進(jìn)一步損傷的作用。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

劉文：設(shè)計(jì)研究方案，起草及修訂論文；章尹崗、別志霞：資料搜集整理；解為慈、葉迎春：實(shí)施研究過程，收集和分析數(shù)據(jù)，論文審核