miR-21下調程序性死亡細胞4對抑制裸鼠腎細胞癌腫瘤轉化和增殖的實驗研究

吳佳成，陸雅君，姜力

腎細胞癌(RCC)是第三種最常見的泌尿系癌[1]，其中一些RCC患者發(fā)生轉移性疾病，而這些患者的5年生存率僅為2%[2]，因此，對新的治療方法進行進一步的篩選和研究是十分必要的。

miRNAs是一種非編碼的小RNA[3-4]，它的異常表達與人類疾病有關，尤其是惡性腫瘤。有越來越多的報道顯示某些miRNA的異常表達可導致腫瘤生長或者減弱惡性腫瘤對放化療的敏感度[5-6]。miR-21的過表達參與了與癌發(fā)生相關的各種過程，包括抑制凋亡、促進細胞增殖和刺激腫瘤生長[7-8]。程序性細胞凋亡因子4(PDCD4)已被證明是腫瘤轉化的抑制劑。PDCD4基因在小鼠表皮克隆遺傳變異體JB6細胞系統(tǒng)中的表達產物被鑒定為64 kDa蛋白質，在抗腫瘤細胞中優(yōu)先表達[7，9]。研究表明PDCD4含有miR-21結合位點，并通過調節(jié)與癌癥進展相關的各種過程而起到腫瘤抑制劑的作用[7-10]。有研究證明miR-21在RCC組織和細胞系中顯著過度表達，而PDCD4受miR-21負調控[11]。

本研究的目的是確定PDCD4和miR-21在裸鼠腎癌模型中的作用和兩者之間的相互作用，以及沉默PDCD4對RCC腫瘤細胞生長和侵襲的影響，而這有望成為治療腎癌的有效新策略。

1 材料與方法

本實驗于2017年9月—2018年1月于中國醫(yī)科大學沈北新校區(qū)實驗中心完成。本研究嚴格按照我國“國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南”的建議，所有手術均在1%戊巴比妥鈉麻醉下(70 mg/kg)進行，并盡一切努力減少動物痛苦。

1.1 飼養(yǎng)裸鼠和細胞培養(yǎng)物 雄性BALB/c裸鼠(n=40)獲自中國醫(yī)科大學動物實驗中心。周齡5～6周，體質量20～23 g，在20～26℃的SPF(無特定病原體)食物條件下，實驗前飼喂1周，相對濕度40%～70%和12 h的明暗循環(huán)。所有食物都用高溫蒸汽消毒(45 min，120℃)進行處理。所有的水用鹽酸酸化并調節(jié)至pH 2.5～2.8。腎細胞癌786-O細胞獲自中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)學中心(北京)，并在細胞庫建議的條件下培養(yǎng)。試劑：0.05 mg/ml牛垂體提取物、5 ng/ml人重組表皮生長因子，50 mg/ml青霉素和50 mg/ml鏈霉素(美國賽默飛世爾科技公司)，10%胎牛血清(美國亞特蘭大生物制品公司)。將細胞維持在37℃的潮濕空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中。染料木黃酮和10%二甲基亞砜(15ml)處理亞混合的786-O細胞(60%～70%混合)。

1.2 RNA干擾測定 在轉染前將786-O細胞(1×106個細胞，60%～80%混合)在不含抗生素的6孔組織培養(yǎng)皿中溫育24 h。用PDCD4 siRNA和陰性對照siRNA轉染786-O細胞，并研究沉默PDCD4對腫瘤細胞生長、增殖和侵襲的影響。將小干擾RNA(siRNA)轉染試劑復合物(#AM16708A; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific，Inc。)與Lipofectamine 2 000(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific，Inc。)混合，隨后加入細胞。在本研究中使用的siRNA的序列如下：NC siRNA引物序列，5'-GCUGCUUTGGACAAGGCUATC-3'和5'-UAGCCUAGUCCAAAGCAGCAT-3'；PDCD4 siRNA引物序列，5'-GCUGCUUUGGACAAGGCUATT-3'和5'-UAGCCUUGUCCAAAGCAGCTT-3'。在37℃孵育6 h后，更換培養(yǎng)基并將細胞在補充有10%熱滅活的FBS的RPMI-1640(Gibco; Thermo Fisher Scientific，Inc。)中培養(yǎng)不同的時間。同時，用對照siRNA作為對照組轉染細胞。

1.3 裸鼠腎癌模型建立 將24只雄性裸鼠按隨機數(shù)字表法分為3組以調查miR-21的作用：陰性對照組(NC，n=8)，miR-21模擬物組(n=8)和miR-21抑制劑組(n=8)。將0.1 ml 786-O細胞懸液(1×106個細胞)皮下移植到小鼠的腋下，隨后每天注射NC siRNA(#AM17110; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific，Inc。)，pre-miR-21(模擬)或抗miR-21(抑制劑)(#A25576; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific，Inc。)。引物的序列如下：pre-miR-21引物序列，5'-CATCCTUCUTGAAGUGACUC-3'和5'-CGCUCUAUGACGUAUGGAGGU-3';抗miR-21引物序列，5'-GATCCAUCUTCGAAGUGACTT-3'和5'-UGCUCU TUGACGUAUGGAGTT-3'; NC siRNA引物序列，5'-UUCACCGUACGUCUCACCUGT-3'和5'-ACUGGAACCUCUCGCGGAATT-3'。進行MTT分析(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)以檢測細胞活力。將細胞接種到96孔板(6.0×103個細胞/孔)中并在正常培養(yǎng)條件下放置。將細胞與MTT(每孔5 mg/ml)一起溫育4 h。用二甲基亞砜溶解甲crystals晶體。使用PBS作為對照。使用Infinite M200 PRO多模式酶標儀(Tecan Benelux BVBA，Mechelen，Belgium)測量490 nm波長處的吸光度。在注射細胞之前檢測細胞活力以確保細胞處于對數(shù)期。移植后共16 d，腫瘤形成率為100%，處死小鼠，收集腫瘤并稱重。使用逆轉錄—定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)分析癌組織中miR-21和PDCD4 mRNA的表達。

1.4 使用免疫組織化學和蛋白質印跡 將16只BALB/c雄性祼鼠按隨機數(shù)字表法分為2組：NC(n=8)和PDCD4siRNA(n=8)。將786-O細胞皮下移植到小鼠的腋下，然后每日注射NC siRNA或PDCD4 siRNA(#AM16708A; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific，Inc。)。 NC siRNA，5'-GCUGCUUTGGACAAGGCUATC-3'和5'-UAGCCUAGUCCAAAGCAGCAT-3'; PDCD4 siRNA，5'-GCUGCUUUGGACAAGGCUATT-3'和5'-UAGCCUUGUCCAAAGCAGCTT-3'。移植后將腫瘤從小鼠中取出并稱重16 d。將戊巴比妥鈉(150 mg/kg，1%)注射到每只小鼠中進行安樂死。

1.5 免疫組化染色 對于免疫組織化學分析，將小鼠癌組織用10%福爾馬林緩沖液固定并包埋在石蠟中。切片(2 μm厚)在使用前1天切割。所有切片脫蠟并用分級乙醇脫水(99%、95%、85%和75%)。然后將切片在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.2; 37℃)中洗滌10 min。通過在室溫下在含有3%H2O2的甲醇中溫育10 min來淬滅內源性過氧化物酶活性，然后在95℃加熱30 min以修復抗原并最終用PBS洗滌。為了最大化免疫組織化學信號，使用以下2種策略：檸檬酸鹽緩沖液中的抗原修復和生物素化酪胺的信號放大。將組織切片在4℃用PDCD4抗體(稀釋液，1∶100;#ab105998; Abcam，Cambridge，UK)溫育過夜。隨后使用生物素化山羊抗兔抗體(稀釋度，1∶5 000;#SAB4504290; Sigma-Aldrich; Merck KGaA)進行檢測，并將組織切片在37℃孵育20 min。使用二氨基聯(lián)苯胺作為發(fā)色團，并將載玻片用Mayer's蘇木精復染。由2位病理學專業(yè)人員在400倍的熒光顯微鏡(Olympus BX41; Olympus Corporation，Tokyo，Japan)下獨立觀察結果。NC組一抗用10%非免疫山羊血清代替[6]。

1.6 Western印跡分析 進行蛋白質印跡分析以確定PDCD4的表達。根據(jù)制造商的建議，使用總蛋白提取試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)從組織提取總蛋白。使用BCA測定試劑盒(南京Keygen生物技術有限公司)測量蛋白質的濃度。使用SDS-PAGE將蛋白質樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠上分離，并轉移到hybond polyvinylidene difluoride膜(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA，USA)上。隨后將膜在室溫下在5%無脂牛奶中封閉2 h。在4℃孵育過夜后，用兔或針對PDCD4(1∶10 000;目錄號ab80590; Abcam)或GAPDH(1∶200; Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA)的山羊一級抗體溫育過夜，在室溫下以1∶5 000的稀釋度用山羊抗兔(#SAB2502080; Sigma-Aldrich; Merck KGaA)或小鼠抗山羊二抗(#G8795; Sigma-Aldrich; Merck KGaA)探測膜2 h。使用Super Enhanced Chemiluminescence Plus試劑盒(南京Keygen生物技術有限公司)檢測信號并使用UVP軟件(BioDoc-It成像儀系統(tǒng); UVP，LLC，Upland，CA，USA)定量。使用積分光密度(IOD)比值IO DPDCD4 / IOD GAPDH來表示PDCD4蛋白在280 nm波長處的相對表達[10]。

1.7 RT-qPCR分析 按照生產商的方案，使用RNA分離試劑盒從腫瘤中提取總RNA。如前所述進行成熟miR-21的莖環(huán)RT-qPCR(28)。使用PowerSYBR Green PCR Master混合物(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)以20 μl的終體積進行PDCD4的RT-qPCR，所述終體積包含100 ng cDNA，10 μl主混合物，1 μl ROX和每個引物0.4 pmol/μl。 qPCR循環(huán)條件如下：95℃ 2min，然后95℃ 15 s 和55℃ 30 s，40個循環(huán)，接著60℃ 1 min。熔化曲線是65～95℃。人類U6 mRNA用于標準化莖環(huán)RT-qPCR，GAPDH用于標準化PDCD4 RT-qPCR。將熒光信號正常化至這些內參基因，并將閾循環(huán)(Cq)設定在PCR的指數(shù)階段內。通過比較每個靶PCR的循環(huán)時間來計算相對基因表達。目標PCR Cq值通過減去提供Cq值的U6或GADPH Cq值進行標準化。然后使用以下等式計算處理之間的相對表達水平：相對基因表達=2(Cqsample-Cq對照)[11]。

1.8 EdU摻入細胞增殖測定 將轉染的786-O細胞以4×104個細胞/孔的密度接種于24孔板中，使其黏附5 h時，用PBS洗滌，然后在含有10 μmol/L EdU(廣州瑞寶生物工程有限公司廣州，中國)在37℃孵育2 h。隨后用PBS洗滌細胞，然后在含有2%甲醛，0.5%Triton X-100和300 mmol/L蔗糖的PBS中37℃固定并透化15 min。用PBS洗滌后，使用10%FBS的PBS溶液在環(huán)境溫度下封閉細胞30 min，并通過與熒光疊氮化物偶聯(lián)溶液(#C10310-3; Apollo;廣州RiboBio有限公司)一起孵育以檢測摻入的EdU，在環(huán)境溫度下30 min，用含有0.05%Tween-20的PBS洗滌細胞3次，用DNA染色染料Hoechst 33342孵育30 min鐘并用PBS洗滌。使用熒光顯微鏡拍攝圖像，并從5個不同視野中隨機選擇的≥50個非S期細胞計算核熒光強度。

1.9 軟瓊脂克隆形成測定 除5×102個轉染的786-O細胞外，用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基制備板的頂層(0.3%低熔點瓊脂糖)。 培養(yǎng)板在37.8℃和5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 在第14天捕獲平板的圖像，并使用Quantity One軟件(版本4.0.3; Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)定量集落的數(shù)量。 測定進行3次。 數(shù)據(jù)以平均值表示。

1.10 細胞侵襲測定 使用Transwell小室(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)進行細胞侵襲測定。 使用轉染的NC siRNA細胞作為對照組。 測定進行3次。 在侵襲測定中，將2×104個在無血清培養(yǎng)基中轉染的細胞接種到用Matrigel(BD Biosciences)預先包被的頂部室中。 在37℃孵育24 h后，使用甲醇(100%)將膜固定，然后用0.1%結晶紫染色。 在光學顯微鏡下計數(shù)通過膜的細胞數(shù)量[1]。

1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-21的沉默抑制小鼠腎癌模型中的腫瘤生長 為研究miR-21抑制劑是否抑制腫瘤生長，在miR-21抑制劑治療后測量腫瘤的重量。3組(NC、miR-21模擬物和miR-21抑制劑)的裸鼠模型的腫瘤質量比較見圖1A。與NC組相比，miR-21模擬組的腫瘤重量顯著增加(t=10.31，P<0.01)，miR-21抑制劑組的腫瘤重量顯著降低(t=8.52，P<0.01)。

2.2 miR-21表達的下調增加小鼠腎癌模型中PDCD4蛋白的表達 為評估裸鼠RCC模型中PDCD4和miR-21之間的關聯(lián)，確定用miR-21模擬物或miR-21抑制劑移植786-O細胞是否影響PDCD4的表達。與NC組相比，miR-21抑制劑下調內源性miR-21導致PDCD4蛋白表達顯著增加(t=5.89，P<0.01)。相反，與NC組相比，miR-21模擬組PDCD4蛋白水平顯著降低(t=6.58，P<0.01)，見圖1B、C。與NC組相比，miR-21模擬物組表達顯著上調，而miR-21抑制劑組顯著降低(t=12.11，P<0.05)，見圖1D。然而，3組間PDCD4 mRNA表達無顯著差異(P> 0.05)，見圖1E。

PDCD4的免疫組織化學分析，表明PDCD4定位于細胞質。在miR-21模擬物組中檢測到PDCD4表達的減少或完全喪失。 NC組免疫細胞化學染色深度適中。相反，在miR-21抑制劑組中觀察到PDCD4的強免疫陽性(圖2見封3)。

2.3 沉默PDCD4誘導腫瘤細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲 沉默PDCD4對細胞增殖的影響通過將PDCD4 siRNA和對照siRNA轉染到786-0細胞中進行研究。檢查轉染后增殖細胞786-O細胞的數(shù)量是否有變化，用EdU標記細胞以測量活性DNA合成，用Hoechst 33342標記細胞以說明所有細胞的細胞核。確定PDCD4的沉默顯著促進細胞增殖。根據(jù)熒光顯微鏡分析的結果，包含EdU的新形成的細胞的平均百分比在NC siRNA組中為28.6%，在PDCD4 siRNA轉染的細胞中為44.7%(t=7.99，P<0.01)，見圖3A。

進行集落形成測定以確定PDCD4敲低是否促進786-O細胞的集落形成能力集落形成實驗表明，與NC組相比，PDCD4siRNA轉染組中的集落總數(shù)顯著增加(t=8.11，P<0.01)，見圖3B、C。

3 討 論

本研究首次證明PDCD4受miR-21負調控，此外還能抑制裸鼠腎癌模型中的腫瘤生長和轉移。在先前的研究中，揭示了在核苷酸228-249的PDCD4 3'非翻譯區(qū)內存在miR-21的保守靶位點[7]。據(jù)報道，miR-21能夠調節(jié)Ras /絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶信號通路，因此影響腫瘤的形成。此外，一項薈萃分析表明，miR-21能夠作為各種癌癥預后的重要生物標志物[12]。 Xu等[13]證明miR-21的下調增加了肺癌細胞對順鉑的體外和體內敏感性。Wang等[14]報道肝細胞癌組織中miR-21表達明顯高于正常肝組織，miR-21在轉錄后水平上對腫瘤抑制基因PDCD4有負調控作用，miR-21誘導RCC細胞增殖和侵襲/轉移。PDCD4的表達也與RCC轉移、腫瘤分期和分級顯著正相關。

注：A.各組腫瘤質量比較；B、C.蛋白質印跡的PDCD4圖像和相對于GAPDH蛋白密度分析；D.RT-qPCR確定的miR-21的相對表達； E.通過RT-qPCR測定的PDCD4 mRDN的相對表達。與NC組比較，aP<0.01

注：A.用PDCD4 siRNA和NC siRNA轉染后786-O細胞的增殖能力；B.第14天捕獲的NC siRNA和PDCD4 siRNA轉染的786-O細胞的集落形成測定的圖像；C.在PDCD4 siRNA轉染的組中，786-O細胞的集落形成能力顯著高于轉錄后14天NC組。與NC組比較，aP<0.01

為了進一步研究PDCD4和miR-21之間的關聯(lián)，在本研究中使用BALB / c雄性裸鼠和786-O細胞建立裸鼠腎細胞癌模型。發(fā)現(xiàn)miR-21模擬組的腫瘤重量與NC組相比顯著增加，miR-21抑制劑組的腫瘤重量與NC組相比顯著降低。Western blot分析NC組、miR-21抑制劑組和miR-21模擬組PDCD4的表達。在miR-21模擬組中PDCD4蛋白的表達缺失或減少; 然而，與NC組相比，PDCD4蛋白在miR-21抑制劑組中高度表達。免疫組化顯示相似的結果。另外，3組之間PDCD4 mRNA水平?jīng)]有顯著差異。本研究的結果與先前發(fā)表的人腎癌組織和細胞系研究相似[11]，表明miR-21在轉錄后水平下調PDCD4，并促進細胞集落形成和增殖裸鼠腎癌模型。

研究表明PDCD4是一種腫瘤抑制基因和抗腫瘤治療的潛在靶點。據(jù)報道，在5種類型的人類腫瘤中，包括肺、腦、乳房、結腸和胰腺中的PDCD4表達降低。在結腸癌細胞系中，Wang等[14]已經(jīng)證明PDCD4的下調導致結腸癌細胞侵襲的增加，此外，研究還表明PDCD4的敲低與E-鈣黏蛋白表達的顯著降低和活性β-連環(huán)蛋白在這些細胞核中的積累有關。在同一系列實驗中，PDCD4敲低導致激活蛋白(AP)-1依賴性轉錄增加。這些結果表明，PDCD4表達降低促進癌細胞侵襲，并且這與β-連環(huán)蛋白，E-鈣黏蛋白和AP-1-依賴性轉錄的活化相關。另一項研究表明，PDCD4表達下降與腺樣囊性癌的臨床分期密切相關。同時PDCD4表達下降與RCC中轉移、腫瘤分期和分級顯著正相關。

本研究中關注了PDCD4對miR-21表達的影響。將PDCD4 siRNA轉染入786-O細胞，發(fā)現(xiàn)PDCD4 mRNA和蛋白水平與NC組相比顯著降低。沉默PDCD4也顯著促進了786-O細胞的增殖、遷移和侵襲，與miR-21過表達后觀察到的效果類似。

總之，本研究和先前研究結果表明，PDCD4和miR-21在RCC腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。促進PDCD4表達或抑制miR-21表達有望成為治療腎癌的有效新型治療策略。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

吳佳成：設計研究方案，實施研究過程，分析試驗數(shù)據(jù)，論文撰寫。陸雅君：實施研究過程，資料搜集整理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。姜力：設計課題，提出研究思路，論文審核