探討鈣敏感受體及緊密連接蛋白-14在大鼠腎草酸鈣結(jié)石形成中的作用

李朋，高存祥，王勤章，錢成，徐浩，申茂磊，郝志強(qiáng)，傅家豪，錢彪

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子 832000 2.解放軍69235部隊(duì)衛(wèi)生所，新疆 奎屯 833200)

泌尿系結(jié)石是泌尿系統(tǒng)最常見的疾病之一，常發(fā)部位為腎臟，其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。腎臟部位的結(jié)石主要為草酸鈣等含鈣結(jié)石[1-2]，有研究表明，鈣的代謝異常是導(dǎo)致含鈣尿路結(jié)石形成的重要因素之一，高鈣尿引起尿液相對(duì)過(guò)飽和誘發(fā)了含鈣結(jié)石的形成[3]。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)可通過(guò)上調(diào)髓袢升支粗段(thick ascending limb，TAL)緊密連接蛋白-14(Claudin-14)的表達(dá)，使腎小管TAL鈣的重吸收受到抑制，尿鈣排泄率增加，進(jìn)而形成高鈣尿誘發(fā)了含鈣結(jié)石的形成[4-5]。據(jù)此推測(cè)：CaSR及Claudin-14在大鼠腎草酸鈣結(jié)石的形成過(guò)程中扮演著重要的角色。本研究對(duì)CaSR及Claudin-14在草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程中表達(dá)水平的改變進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)兩者在結(jié)石形成中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，6周齡左右，體質(zhì)量(210±15)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔合格證號(hào)SCXK(新)2013-0001〕。多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(BX40，日本Olympus公司)，CaSR抗體(Abcam公司)、Claudin-14抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.2 大鼠腎結(jié)石模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

參照孫穩(wěn)等[6]的方法制作大鼠腎結(jié)石模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠分為空白對(duì)照組與結(jié)石組，每組各30只?？瞻讓?duì)照組給予正常飲水加每日每只2 mL灌胃兩周；結(jié)石組給予1%乙二醇飲水和2%氯化銨每日每只2 mL灌胃兩周。1～10周，每組每周處死3只大鼠，并取其雙側(cè)腎臟為標(biāo)本。

1.3 腎組織HE染色

將一部分石蠟包埋后的腎組織標(biāo)本制成切片，將切片固定于載玻片上，常規(guī)HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)晶的形成情況及腎臟病理改變，并按照文獻(xiàn)[7]提供的腎臟結(jié)晶分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，0級(jí)判定為陰性結(jié)果，表示腎組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶形成；Ⅰ-Ⅳ級(jí)判定為陽(yáng)性結(jié)果，分別表示腎組織內(nèi)結(jié)晶形成的程度。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

CaSR及Claudin-14的表達(dá)：選取成功建立模型的一部分腎組織做免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用SP法，石蠟包埋后切片4 μm，常規(guī)脫蠟，H2O2處理清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸緣酸緩沖液抗原修復(fù)，血清封閉。滴加CaSR抗體(1∶150) 和Clanudin-14抗體(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，不同濃度酒精和二甲苯脫水，樹膠封片，顯微鏡下觀察1～10周兩組Wistar雄性大鼠腎臟CaSR和Clanudin-14免疫組織化學(xué)染色情況。

2 結(jié)果

2.1 腎組織HE染色

光學(xué)顯微鏡下觀察，造模期間正常對(duì)照組大鼠腎組織冰凍切片內(nèi)未見結(jié)晶沉積，無(wú)病理學(xué)改變(圖1A)。第2周起結(jié)石組部分大鼠腎臟可見腎小管上皮細(xì)胞脫落或腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，及數(shù)量不等透明晶體，多數(shù)晶體以不規(guī)則碎片出現(xiàn)于腎小管中，部分見于集合管、間質(zhì)及被膜下，并伴有部分腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞空泡樣變性及小管上皮腫脹。第5～10周腎組織結(jié)晶量多，細(xì)胞排列紊亂，腎小管多畸形，腎小管管腔擴(kuò)大或因上皮細(xì)胞腫脹而變窄，擴(kuò)大腔內(nèi)多有壞死脫落樣物，腎小球多有形狀不規(guī)則甚至壞死，以腎小管內(nèi)為著(圖1B)。

2.2 腎臟結(jié)晶形成及分級(jí)

正常對(duì)照組大鼠腎組織未見結(jié)晶。第3周起結(jié)石組大鼠腎臟切片可見明亮晶體，主要分布于遠(yuǎn)曲小管，近曲小管及部分腎小球周圍，形態(tài)不規(guī)則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體呈互相連接成片或成堆，結(jié)石組與正常對(duì)照組之間成石率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(因結(jié)石組大鼠在第3周開始成石，而前兩周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計(jì)算成石率時(shí)將兩組內(nèi)前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計(jì)數(shù)之外)。見表1。

表1 兩組大鼠腎組織結(jié)晶分級(jí)

*P<0.05，與對(duì)照組成石率比較。

2.3 腎組織CaSR免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察到，第1～2周結(jié)石組與對(duì)照組大鼠腎組織均有CaSR的表達(dá)但沒(méi)有明顯差異，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，呈棕褐色；第3～10周對(duì)照組大鼠腎組織CaSR的表達(dá)較第1～2周無(wú)明顯變化，但結(jié)石組大鼠腎組織CaSR的表達(dá)強(qiáng)度則逐漸增強(qiáng)且明顯高于對(duì)照組，鏡下可見結(jié)石組腎組織CaSR呈高度表達(dá)且彌漫分布。見圖2。

2.4 腎組織Claudin-14免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果

1～10周在對(duì)照組大鼠腎組織中均未能檢測(cè)到有Claudin-14的表達(dá)；結(jié)石組在第1～2周也未在大鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)有Claudin-14的表達(dá)，但在第3～10周則觀察到在大鼠腎小管髓袢升支粗段有Claudin-14的表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度在持續(xù)增加。見圖3。

3 討論

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一，是導(dǎo)致尿路梗阻和感染的主要原因。泌尿系結(jié)石的結(jié)石成分主要有草酸鈣、尿酸、磷酸鈣草酸鈣混合物、鳥糞石及胱氨酸結(jié)石，其中以草酸鈣結(jié)石等含鈣結(jié)石最為多見[8-10]。尿液中游離鈣增高是泌尿系結(jié)石形成的主要危險(xiǎn)因素[11]，高鈣尿使尿液相對(duì)過(guò)飽和從而誘發(fā)了含鈣結(jié)石的形成。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，在高鈣尿性腎結(jié)石形成過(guò)程中可能存在一個(gè)CaSR-Claudin-14調(diào)控通路，其可通過(guò)促進(jìn)尿鈣排泄參與泌尿系含鈣結(jié)石的形成。鈣敏感受體(CaSR)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族的一員，在調(diào)節(jié)全身Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡中起主要作用[12]。有研究表明，CaSR在腎臟中表達(dá)于腎小管髓袢升支粗段(TAL)[13]，激活后通過(guò)改變細(xì)胞旁途徑的滲透性來(lái)降低腎小管髓袢升支粗段對(duì)鈣的重吸收。緊密連接蛋白(Claudins)是緊密連接結(jié)構(gòu)的膜蛋白，其在上皮細(xì)胞中的旁細(xì)胞途徑中既起到孔隙又起阻礙作用。在腎臟中，claudins決定沿著腎小管的不同腎單位片段的滲透性和選擇性。在髓袢升支粗段，claudins對(duì)鈣的重吸收是非常重要的，并受到鈣敏感受體的嚴(yán)格調(diào)控[14]。緊密連接蛋白-14(Claudin-14)是緊密連接蛋白家族的一員，在腎臟中嚴(yán)格定位于腎小管的髓袢升支粗段(TAL)[14]，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞旁途徑的緊密連接蛋白-16和緊密連接蛋白-19構(gòu)成的陽(yáng)離子通道滲透性調(diào)節(jié)腎小管對(duì)鈣的重吸收。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)激活小鼠腎組織的CaSR，Claudin-14蛋白表達(dá)顯著增高，且尿鈣的排泄也發(fā)生了相應(yīng)程度的增加[4]，證實(shí)CaSR在髓袢升支粗段(TAL)主要是通過(guò)調(diào)節(jié)下游Claudin-14蛋白的表達(dá)來(lái)抑制鈣的重吸收，同時(shí)，腎臟TAL的Claudin-14的表達(dá)主要受該處CaSR的調(diào)控。由此說(shuō)明泌尿系草酸鈣結(jié)石等含鈣結(jié)石的形成與腎組織中CaSR及Claudin-14蛋白的表達(dá)有著緊密的聯(lián)系。

本研究中，第1～2周HE染色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)結(jié)石組與對(duì)照組大鼠腎組織的病理改變無(wú)差異，免疫組化顯示第1～2周兩組大鼠腎組織CaSR表達(dá)水平無(wú)明顯差異且在兩組大鼠腎組織中均未有Claudin-14的表達(dá)。第3周開始HE染色可見結(jié)石組大鼠腎臟切片有明亮晶體；免疫組化觀察到第3周開始到第10周CaSR的表達(dá)程度逐漸增強(qiáng)且明顯高于對(duì)照組，同時(shí)開始發(fā)現(xiàn)有Claudin-14的表達(dá)且表達(dá)強(qiáng)度在逐步增加。而第3～10周對(duì)照組大鼠腎組織HE染色結(jié)果以及腎組織中CaSR的表達(dá)水平與第1～2周相比并未發(fā)生明顯改變。有研究發(fā)現(xiàn)Claudin-14基因在正常腎臟中不表達(dá)，通常在飲水過(guò)少或攝入鈣過(guò)多時(shí)表達(dá)[15]，這與本研究結(jié)果一致：在對(duì)照組大鼠腎組織中未發(fā)現(xiàn)有Claudin-14的表達(dá)。

CaSR和Claudin-14表達(dá)水平的改變說(shuō)明二者在大鼠腎組織含鈣結(jié)石的形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活腎組織中的CaSR，從而引起其下游Claudin-14高度表達(dá)，Claudin-14可以阻斷由Claudin-16和Claudin-19構(gòu)成的細(xì)胞外陽(yáng)離子通道[16]，使腎小管髓袢升支粗段上皮細(xì)胞膜上離子通道的滲透性發(fā)生改變，導(dǎo)致該部位Ca2+的重吸收障礙[17]，Ca2+的排泄增加[18]，最終尿路中出現(xiàn)大量的Ca2+累積，大大增加了形成結(jié)石的可能性。

綜上所述，CaSR和Claudin-14的表達(dá)強(qiáng)度在大鼠草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程中存在動(dòng)態(tài)改變，這種動(dòng)態(tài)的改變?cè)诮Y(jié)石形成過(guò)程中起著非常重要的作用，之后將進(jìn)一步探討泌尿系含鈣結(jié)合的形成機(jī)制，為臨床治療提供有力依據(jù)。