Cd在小麥不同生育期器官及亞細(xì)胞中的分布

孫芳立，蘇忠亮，郭慶增

(1.青島科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，山東 青島 266042；2.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、公眾環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，糧食安全越來(lái)越受到人們的重視.其中，重金屬對(duì)糧食作物的危害是糧食安全亟待解決的問(wèn)題之一.據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在20世紀(jì)90年代，我國(guó)遭受Cd污染的農(nóng)田面積超過(guò)了1.3×104hm2，近些年Cd的污染狀況還有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢(shì)[1].Cd一旦對(duì)土壤造成污染，不僅對(duì)植物有嚴(yán)重的毒害作用，而且會(huì)進(jìn)一步通過(guò)食物鏈最終危害人體健康[2].小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，在世界上也是主要的糧食作物之一.目前有關(guān)Cd對(duì)水稻污染的報(bào)道很多[3-5]，但是Cd對(duì)小麥的污染機(jī)制研究相對(duì)較少.不同的重金屬在不同的植物細(xì)胞內(nèi)，其富集和分布是存在差異的，即使是同種重金屬，在不同植物組織細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，其富集也存在很大差異.植物吸收重金屬后，會(huì)對(duì)重金屬在組織水平和亞細(xì)胞水平進(jìn)行選擇性分配.這種分配與植物的重金屬防御機(jī)制密切相關(guān)[6-7].Cd是耕地土壤中受到廣泛關(guān)注的重金屬污染物之一，因此研究Cd在小麥亞細(xì)胞中的富集規(guī)律對(duì)于研究植物的重金屬防御機(jī)制和食品安全具有重要的意義.

重金屬在小麥不同器官中的富集規(guī)律是不同的[8-9]，主要的富集器官是根.Cd在小麥的不同生育期，其富集規(guī)律也有很大的差異[10].在小麥的幼苗期，Cd在小麥根與莖葉中的富集濃度隨著處理濃度的增加而增加[11]，但是在其他的生育期重金屬吸收Cd還需要能量的主動(dòng)運(yùn)輸，因此Cd的富集濃度不再與處理濃度呈正相關(guān)[12].Cd在小麥的器官中富集后，會(huì)進(jìn)一步毒害小麥的組織細(xì)胞，進(jìn)而影響小麥的正常生長(zhǎng)發(fā)育.植物為抵御重金屬的毒害，自身具有一套抵御裝置.例如，細(xì)胞壁會(huì)與Cd結(jié)合，限制Cd進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)胞[13]；雖然Cd在根細(xì)胞中的富集濃度增加，但是在莖葉中的富集濃度不一定會(huì)隨之增加[14].

目前關(guān)于Cd在小麥不同器官中的富集規(guī)律已經(jīng)有了一些報(bào)道[10，15-16]，但是在亞細(xì)胞水平上關(guān)于Cd在小麥全生育期的研究卻鮮有報(bào)道.小麥在世界上也是十分重要的糧食作物，但是目前研究重金屬對(duì)植物的毒害實(shí)驗(yàn)，大都是采用培養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)或者是盆栽試驗(yàn)[17]，這種培養(yǎng)方法與小麥在田間的實(shí)際生長(zhǎng)存在很大的差異.

小麥?zhǔn)嵌拘詫?shí)驗(yàn)常用的標(biāo)準(zhǔn)物種之一，筆者采用田間小區(qū)試驗(yàn)，保證水肥、培養(yǎng)等條件與田間小麥一致，研究Cd在小麥全生育期中亞細(xì)胞中的富集規(guī)律，以便進(jìn)一步探討小麥對(duì)Cd的解毒機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

該研究在青島市城陽(yáng)京口村進(jìn)行，以Cd為研究對(duì)象，參照土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-1995)，重金屬Cd設(shè)置5個(gè)梯度：對(duì)照(CK)、低劑量(L1)、中劑量(L2)、高劑量(L3)以及超高劑量(L4)，其濃度梯度分別為0，1，3，5，8 mg·kg-1.Cd以一層過(guò)篩土一層CdSO4溶液形式噴灑于每個(gè)小區(qū)，并翻土混勻加入土壤中.小區(qū)土壤本底相關(guān)理化性質(zhì)見(jiàn)表1.試驗(yàn)田共設(shè)置45相同的個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為6 m2，通過(guò)在小區(qū)之間增設(shè)PVC隔板或田埂進(jìn)行隔離.小麥在2014年10月8日播種，每小區(qū)播種量110 g.分別在分蘗期、拔節(jié)-孕穗期、抽穗-揚(yáng)花期、灌漿期對(duì)小麥進(jìn)行采樣并測(cè)定其不同亞細(xì)胞中Cd的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試2次，最終結(jié)果取2次測(cè)量值的平均.

表1 田間小區(qū)土壤本底理化性質(zhì)

1.2 材 料

實(shí)驗(yàn)供試材料為濟(jì)麥22.實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，實(shí)驗(yàn)所涉及的一些常規(guī)化學(xué)試劑主要是：硝酸、高氯酸、鹽酸、蔗糖、三異丙基乙磺酰、鹽酸、二硫赤鮮糖醇，試劑規(guī)格為分析純，均購(gòu)自中國(guó)天津市巴斯夫化工有限公司.

主要儀器與設(shè)備：Hitachi超速冷凍離心機(jī)CR21GIII,日本日立公司;AA600型石墨爐原子吸收儀,美國(guó)PE公司;AA400型火焰原子吸收儀,美國(guó)PE公司;玻璃研缽、電加熱板、通風(fēng)櫥.

1.3 方 法

植物樣品前期處理[18]：每個(gè)試驗(yàn)田隨機(jī)選擇5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行樣品采集，用自來(lái)水沖洗掉附著在小麥鮮樣表面的浮土，再擦干水.然后分別剪下根和莖葉，剪碎后稱(chēng)量.

4 ℃冰浴研磨：剪碎后的小麥莖葉、根的鮮樣各稱(chēng)取1.000 0 g，放入洗凈、烘干后的玻璃研缽中，分次加入5mL預(yù)冷的提取液研磨成勻漿(提取液組成為：250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)和1.0 mmol·L-1的二硫赤蘚糖醇)，然后將勻漿轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，再用15 mL同樣的提取液多次洗滌研缽中的殘留物，一并轉(zhuǎn)移到離心管中.

4 ℃冷凍離心：參照文獻(xiàn)[18-19]的方法將研磨成勻漿的小麥鮮樣在4 ℃的條件下冰浴離心. 首先將勻漿在3 000 r·min-1下離心15 min，沉淀為含有細(xì)胞壁的殘?jiān)糠?再將上清液在15 000 r·min-1的條件下二次離心30 min，二次離心的上清液為細(xì)胞質(zhì)溶液，二次離心殘?jiān)鼮樾←溂?xì)胞器組分[19].

消化：參照文獻(xiàn)[18-19]的方法向離心后的一次離心上清液、二次離心上清液和二次離心的殘?jiān)謩e加入10 mL體積比為1∶9的HNO3-HClO4溶液，酸化反應(yīng)一段時(shí)間后，將其轉(zhuǎn)移到250 mL的錐形瓶中. 用5 mL體積比為1∶9的HNO3-HClO4溶液洗滌盛放二次離心殘?jiān)碾x心管，而盛放兩次離心上清液的離心管用去離子水洗滌，并將洗滌液一并轉(zhuǎn)移到錐形瓶中. 在錐形瓶上放入漏斗進(jìn)行冷卻水回流，然后將錐形瓶放到電加熱板開(kāi)始加熱. 加熱采取逐步升溫的方法，先將溫度調(diào)到120 ℃加熱30 min，隨后升溫到180 ℃加熱30 min，然后再升溫至220 ℃進(jìn)行消化. 1 h后取下漏斗，加熱到近干，再加入2 mL體積比為1∶3的H3PO4溶液，并用10～20 mL去離子水沖洗錐形瓶壁，將錐形瓶放到電加熱板上加熱10 min，取下，冷卻至室溫[19].

測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法將消化好的溶液轉(zhuǎn)移，定容，用石墨爐原子吸收儀測(cè)定Cd含量.

在小麥的成熟期以及灌漿期，由于小麥葉片以及麥穗開(kāi)始干枯發(fā)黃，難以研磨進(jìn)行亞細(xì)胞分離，因此只測(cè)得地上部分干樣數(shù)據(jù)進(jìn)行總質(zhì)量分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd在小麥不同生育期各亞細(xì)胞中的分布

在不同的生育期，Cd的富集規(guī)律也是不同的.除了拔節(jié)-孕穗期Cd的主要富集器官是葉之外，Cd在小麥不同時(shí)期的主要富集器官是根.在亞細(xì)胞水平，Cd的富集位點(diǎn)以富集量大小依次是細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞壁>細(xì)胞器，具體結(jié)果如圖1所示.

圖1 小麥不同生育期不同器官中Cd的濃度分布

如圖1所示，Cd在分蘗期、拔節(jié)-孕穗期、抽穗-揚(yáng)花期小麥的根、莖葉細(xì)胞的各個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的富集濃度是隨著處理水平的增加而增加.總體來(lái)看，Cd是主要富集在細(xì)胞質(zhì)溶液中，其次是細(xì)胞壁，而在細(xì)胞器中的富集濃度最少.這與楊衛(wèi)東、宋曉慧等[20-21]的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步詮釋和體現(xiàn)了小麥對(duì)重金屬Cd的防御機(jī)制.土壤中的重金屬在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)首先與植物細(xì)胞細(xì)胞壁上的非原生質(zhì)體結(jié)合.這是由于原生質(zhì)體含有的大量的多糖分子或蛋白質(zhì)分子具有大量活性基團(tuán)(如:羧基、羥基、氨基).這些活性基團(tuán)通過(guò)配位作用將Cd固定在細(xì)胞壁表面，阻止Cd進(jìn)入細(xì)胞，達(dá)到減少重金屬跨膜運(yùn)輸?shù)哪康膹亩档椭亟饘賹?duì)細(xì)胞的毒害作用[15，22-23].但是當(dāng)土壤中的重金屬含量過(guò)多，細(xì)胞壁不足以固定這些重金屬時(shí)，重金屬就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞的第二種防御機(jī)制就開(kāi)始發(fā)揮作用.植物為降低重金屬的危害，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器即會(huì)分泌細(xì)胞膜類(lèi)似物將進(jìn)入細(xì)胞的重金屬進(jìn)行包裹固定，這一防御機(jī)制叫作區(qū)隔化作用[13].重金屬的區(qū)隔化極大地阻止了重金屬進(jìn)入細(xì)胞器，防止重金屬進(jìn)一步危害維持細(xì)胞正常生理功能的細(xì)胞器的功能和結(jié)構(gòu).Cd在進(jìn)入細(xì)胞之后，除了會(huì)進(jìn)行區(qū)隔化，還會(huì)與細(xì)胞中的植物絡(luò)合素以及金屬硫蛋白中的巰基官能團(tuán)結(jié)合，降低Cd的毒性[24].

如圖1(a)所示，Cd在灌漿期主要的富集器官是根，在葉中的富集濃度相對(duì)較低.這是由于根是直接與土壤中重金屬接觸的器官，Cd首先在根部富集之后，經(jīng)過(guò)根的截留作用，才會(huì)向地上部分轉(zhuǎn)移.這也是植物對(duì)重金屬的一種解毒機(jī)制的體現(xiàn)，將重金屬固定在根部，防止其向地上部分轉(zhuǎn)移，危害植物的其他重要器官[11].Cd在小麥根細(xì)胞的各個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的富集濃度隨著處理水平的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì).Cd在根細(xì)胞各亞細(xì)胞中的富集濃度高低為：細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞壁>細(xì)胞器.Cd在葉細(xì)胞中的富集濃度隨著處理水平的增加一直呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，其在葉細(xì)胞中富集濃度依次為：細(xì)胞壁≈細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞器.Cd在根與莖葉這兩種細(xì)胞器中不同的重金屬分布也進(jìn)一步證實(shí)了，在低濃度Cd脅迫下，細(xì)胞器的固定是細(xì)胞主要的解毒機(jī)制，隨著Cd的濃度增加，細(xì)胞質(zhì)溶液的區(qū)隔化作用更加顯示出優(yōu)勢(shì).

如圖1(b)所示，Cd在拔節(jié)-孕穗期主要的富集器官是葉，在根中的富集濃度相對(duì)較低.這是由于在小麥的根細(xì)胞中Cd的富集濃度相對(duì)于分蘗期較低，而在葉細(xì)胞中的富集濃度比較高，這是由于在這一時(shí)期，重金屬Cd更多地向地上部分進(jìn)行了轉(zhuǎn)移.分析其原因，可能是由于在拔節(jié)-孕穗期，小麥的地上部分進(jìn)入迅速增長(zhǎng)的階段，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率高于積累速率，Cd會(huì)隨著其他物質(zhì)一起向地上部分轉(zhuǎn)移，所以Cd的富集部位也開(kāi)始從地下部分轉(zhuǎn)移到地上部分，主要的富集器官是葉.Cd在根細(xì)胞各亞細(xì)胞中的富集濃度依次為：細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞壁>細(xì)胞器.Cd在葉細(xì)胞中的富集濃度隨著處理水平的增加一直呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其在葉細(xì)胞中富集濃度依次為：細(xì)胞壁≈細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞器.這一點(diǎn)與分蘗期小麥亞細(xì)胞對(duì)Cd的富集規(guī)律一致.

如圖1(c)所示，Cd在抽穗-揚(yáng)花期主要的富集器官是根.Cd在小麥根、葉細(xì)胞的細(xì)胞壁上的富集濃度是隨著處理水平的增加而增加，在葉細(xì)胞質(zhì)溶液中的富集濃度是持續(xù)增加，而在根、葉的其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中則是先增加然后達(dá)到平衡.Cd在根、葉器官的各亞細(xì)胞中的富集規(guī)律呈現(xiàn)為:細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞壁>細(xì)胞器.

如圖1(d)所示，Cd在灌漿期主要的富集器官是根.Cd在小麥根細(xì)胞的各個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的富集濃度也是隨著處理水平的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在處理水平為L(zhǎng)3時(shí)富集濃度達(dá)到最大，說(shuō)明在小麥灌漿期，L3處理水平是小麥所能承受的臨界濃度.當(dāng)處理濃度大于此濃度時(shí)，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，使小麥細(xì)胞對(duì)Cd的富集濃度反而下降；也可能會(huì)使細(xì)胞的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的機(jī)制受損，導(dǎo)致小麥根部吸收物質(zhì)的濃度降低，從而Cd的富集濃度也隨之降低.在根細(xì)胞各亞細(xì)胞中的富集特征是:細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞壁>細(xì)胞器.Cd在葉細(xì)胞中的富集濃度隨著處理水平的增加而增加，其在葉細(xì)胞中的富集特征是細(xì)胞壁≈細(xì)胞質(zhì)溶液>細(xì)胞器.

如圖1(e)所示，Cd在成熟期的主要富集器官是根，且Cd在根以及葉中的富集規(guī)律均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì).Cd的富集濃度在處理水平為L(zhǎng)2時(shí)達(dá)到最大，說(shuō)明在成熟期，處理水平L2為小麥對(duì)Cd的承受臨界濃度.

2.2 Cd在小麥全生育期根、葉細(xì)胞中的分布規(guī)律

在根細(xì)胞中，Cd在小麥中的富集濃度隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)，分蘗期和灌漿期的富集濃度要高于拔節(jié)-孕穗期和抽穗-揚(yáng)花期；在葉細(xì)胞中，Cd在小麥亞細(xì)胞中的富集濃度呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，分蘗期和灌漿期的富集濃度則低于拔節(jié)-孕穗期和抽穗-揚(yáng)花期.即使是在相同的濃度下，不同的生育期，Cd在根細(xì)胞以及葉細(xì)胞中的分布都是不同的.

圖2為Cd在小麥全生育期根細(xì)胞和葉細(xì)胞中的分布規(guī)律.

圖2 不同生育期中Cd在小麥器官中的分布

如圖2所示，隨著小麥的生長(zhǎng)發(fā)育，在每一處理水平下Cd在根細(xì)胞中的富集濃度出現(xiàn)先降低后增加的現(xiàn)象，而在葉細(xì)胞中的富集濃度則出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象.分析其原因，可能是在小麥的分蘗期，小麥生長(zhǎng)發(fā)育還沒(méi)有成熟，機(jī)體對(duì)重金屬的防御機(jī)制還不完善.所以Cd在根細(xì)胞中的富集濃度要高于其他的生育期[10].小麥在拔節(jié)-孕穗期發(fā)育迅速，其生長(zhǎng)速率要高于積累速率，所以Cd的總富集濃度出現(xiàn)下降趨勢(shì).另外，這一時(shí)期是小麥迅速長(zhǎng)高的階段，重金屬離子會(huì)隨著其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向地上部分轉(zhuǎn)移，所以Cd在葉中的富集濃度要高于根，并且也高于其他幾個(gè)時(shí)期[10].在抽穗-揚(yáng)花期，小麥的生長(zhǎng)速率要大于重金屬的吸收速率，所以重金屬在小麥根、葉中的富集濃度下降.在灌漿期，小麥開(kāi)始趨于成熟，根開(kāi)始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，所以在這個(gè)時(shí)期小麥在根中的富集濃度開(kāi)始上升[24].

3 結(jié)束語(yǔ)

除拔節(jié)-孕穗期，Cd在小麥中的主要富集器官是葉外，其他生長(zhǎng)時(shí)期，Cd在小麥中的主要富集器官都是根.這是植物對(duì)重金屬的一種解毒機(jī)制的體現(xiàn)，將重金屬固定在根部，防止其向地上部分轉(zhuǎn)移危害植物的其他重要器官.小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，根阻止Cd向地上部分的轉(zhuǎn)移，保證了主要的食用部分籽粒中的富集濃度較低，對(duì)于食品安全是有利的.

在亞細(xì)胞水平，無(wú)論是哪個(gè)生育期，Cd在小麥中的主要富集部位是細(xì)胞質(zhì)溶液，其次是細(xì)胞壁，而在細(xì)胞器中的富集濃度非常低.這說(shuō)明細(xì)胞壁對(duì)重金屬的絡(luò)合以及細(xì)胞質(zhì)溶液對(duì)Cd的區(qū)隔化可能是小麥解毒的主要機(jī)制.但是，要闡明重金屬對(duì)小麥的毒害機(jī)制還需要進(jìn)一步研究小麥超微結(jié)構(gòu)以及相關(guān)酶系的變化.

在同一種處理水平下，不同的生育期，Cd在小麥中的富集規(guī)律是不同的，因此可以為進(jìn)一步建立一種新的重金屬監(jiān)測(cè)機(jī)制提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ).