基于同軸流技術(shù)的肝組織生物3D打印研究

杜顯彬 徐銘恩,* 王 玲, 周永勇

1(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院，杭州 310018)2(浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)3(浙江省杭州捷諾飛生物科技股份有限公司，杭州 310018)

引言

再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域在過去幾十年里取得了重大進(jìn)步，人造組織如皮膚[1-2]，軟骨[3-4]和角膜[5]等已經(jīng)獲得成功。由于這些組織有簡(jiǎn)單的幾何形狀、低的細(xì)胞耗氧，所以對(duì)血管化的要求較低。然而，制造厚的、復(fù)雜的組織或器官，如心、肝、腎等，由于缺乏供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的血管系統(tǒng)，其尺寸和功能受到了限制[6]。有限的氧氣擴(kuò)散速度，使細(xì)胞無法遠(yuǎn)離血管200 μm存活[7]。沒有血管系統(tǒng)，厚的組織或器官不能進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲取、氣體交換和廢物清除，會(huì)產(chǎn)生不均勻的細(xì)胞分布和有限的細(xì)胞活動(dòng)產(chǎn)物[8]。因此，組織內(nèi)相連的三維血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)實(shí)現(xiàn)人造組織的功能起著至關(guān)重要的作用[9-11]。對(duì)工程組織內(nèi)部的通道進(jìn)行灌流，可以為細(xì)胞提供足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)清除細(xì)胞代謝廢物，避免壞死組織的形成[12]。

近年來，生物三維打印成為研究的熱點(diǎn)，通過控制細(xì)胞和生物材料的沉積，制造三維血管網(wǎng)絡(luò)[13-15]。常見的方法是基于犧牲材料的打印，模板墨水首先嵌入在一個(gè)水凝膠模型中，隨后去除犧牲模板墨水，獲得空心的類血管結(jié)構(gòu)[16-20]。制造血管通道后，通過灌注內(nèi)皮細(xì)胞懸液，使內(nèi)腔附著內(nèi)皮細(xì)胞。但是，這個(gè)方法涉及復(fù)雜的犧牲材料打印以及去除過程。Dai等在纖維蛋白中促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，成功地實(shí)現(xiàn)了血管生成[21]。研究已經(jīng)證明，血管網(wǎng)絡(luò)能提高細(xì)胞在組織中的生存能力，通道附近的區(qū)域和遠(yuǎn)離通道的區(qū)域相比，細(xì)胞存活率表現(xiàn)出顯著差異。研究同時(shí)表明，內(nèi)腔表面覆蓋著內(nèi)皮細(xì)胞的血管通道，有助于血漿蛋白質(zhì)和右旋糖酐分子的擴(kuò)散。

Norotte等使用組織小球在模具內(nèi)打印，瓊脂糖作為臨時(shí)支架來制造內(nèi)腔，隨后組織小球相互融合，構(gòu)建的血管直徑在0.9～2.5 mm之間[22]。Xu等提出了一種噴墨式生物打印系統(tǒng)，通過融合封裝進(jìn)成纖維細(xì)胞的液滴，垂直制造Z形管道[23]。Yan等利用激光輔助式的微滴打印機(jī)，在氯化鈣交聯(lián)池中沉積海藻酸鈉液滴，打印了直徑約3 mm的海藻酸鈉短管[24]。然而，這些血管制造方法步驟復(fù)雜且可控性低。

生物打印血管網(wǎng)絡(luò)的另一種方式是使用同軸打印裝置。同軸噴頭可以利用快速交聯(lián)的水凝膠生物墨水直接制造中空細(xì)絲，生成光滑、連續(xù)、任意長(zhǎng)度的內(nèi)腔[25-26]。愛荷華大學(xué)的Zhang等在中空細(xì)絲中封裝了成纖維細(xì)胞，并嵌入一個(gè)大的組織結(jié)構(gòu)中[26]。相比分散在水凝膠中的細(xì)胞，管道周圍的細(xì)胞有更高的存活率。在國(guó)內(nèi)，上海大學(xué)的李瑜等研究了同軸擠出的材料濃度對(duì)中空纖維凝膠率與溶脹度的影響[27]。劉媛媛等對(duì)中空纖維建立了理論模型，定量分析了中空纖維在三維搭接中的拉伸變形，并進(jìn)行了三維支架的制備試驗(yàn)及性能測(cè)試與分析[28]。

本研究利用同軸噴頭制造封裝進(jìn)肝細(xì)胞的中空細(xì)絲，結(jié)合生物3D打印系統(tǒng)，疊層制造含微通道網(wǎng)絡(luò)的肝組織。首先研究了細(xì)絲制造參數(shù)(如材料擠出速率、材料濃度)對(duì)中空細(xì)絲尺寸和出絲速度的影響，隨后打印了含完整微通道網(wǎng)絡(luò)的仿生肝組織，并檢測(cè)了打印過程對(duì)細(xì)胞的存活率的影響，最后對(duì)肝組織進(jìn)行分組培養(yǎng)，灌流組和非灌流組形成對(duì)比，檢測(cè)了兩種培養(yǎng)方式下細(xì)胞存活率的變化。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海藻酸鈉粉末(FMC，USA)用紫外燈照射30 min，溶解在去離子水中，用磁力攪拌機(jī)300轉(zhuǎn)的速度攪拌12 h，制備2%～7%(W/V)的海藻酸鈉溶液。用去離子水溶解氯化鈣粉末(Sigma，USA)，配置2%～7%(W/V)的氯化鈣溶液，氯化鈣溶液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，在室溫下保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

將同軸噴頭固定于生物3D打印機(jī)(Bio-Printer Pro,Regenovo Biorechnology Co.,Ltd)的移動(dòng)軸上，由打印機(jī)的軟件系統(tǒng)控制打印機(jī)的運(yùn)動(dòng)。

擠出系統(tǒng)主要由兩臺(tái)注射泵和同軸噴頭組成，如圖1所示。兩臺(tái)獨(dú)立串聯(lián)控制的注射泵(瑞創(chuàng)RSP01-BD)用于定流量分配海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液(見圖1(a))，同軸噴頭主要由內(nèi)供料管、外供料管、內(nèi)針、外針組成。外針長(zhǎng)于內(nèi)針約1 mm，有利于中空細(xì)絲的穩(wěn)定成形。裝有海藻酸鈉溶液的料筒與內(nèi)供料管之間使用聚四氟乙烯管連接，裝有氯化鈣溶液的料筒與外供料管之間使用聚四氟乙烯管連接。本次實(shí)驗(yàn)，外針使用17號(hào)針(外徑1.47 mm，內(nèi)徑1.07 mm)，內(nèi)針使用23號(hào)針(外徑0.63 mm，內(nèi)徑0.34 mm)。

圖1 同軸擠出系統(tǒng)。(a)擠出系統(tǒng)示意；(b)交聯(lián)原理；(c)同軸噴頭截面Fig.1 Coaxial extrusion system. (a)Extrusion system representative image；(b)Crosslinking schematic；(c)Coaxial nozzle cross section

1.3 打印路徑

由于同軸噴頭的特殊性，形成中空細(xì)絲的過程無法間斷，因此打印路徑必須連續(xù)。設(shè)計(jì)的長(zhǎng)方體打印路徑如圖2所示，第二層的起點(diǎn)連接第一層的終點(diǎn)，第三層的起點(diǎn)連接第二層的終點(diǎn)，以此類推。模型的打印路徑連續(xù)，打印過程無需斷絲，且保證了內(nèi)部通道的完整性。

圖2 打印路徑示意Fig.2 The schematic diagram of printing path

1.4 制造過程

打印時(shí)，同軸噴頭被固定在生物3D打印機(jī)的移動(dòng)軸上，待同軸噴頭穩(wěn)定出絲后，打印機(jī)移動(dòng)軸帶動(dòng)同軸噴頭按照預(yù)先規(guī)劃好的打印路徑運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)的疊層制造。氯化鈣溶液用注射泵輸送至同軸噴頭內(nèi)針，海藻酸鈉溶液通過注射泵輸送至同軸噴頭外針和內(nèi)針之間的夾層。海藻酸鈉溶液與其他二價(jià)陽離子(如鈣離子、鎂離子等)混合時(shí)，會(huì)發(fā)生離子交換，快速形成有一定機(jī)械強(qiáng)度的凝膠[29]。圖1(b)為水凝膠和交聯(lián)劑發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的原理，圖1(c)為同軸噴頭的橫截面。同軸噴頭外針中的水凝膠溶液被交聯(lián)，形成管壁，內(nèi)針中的交聯(lián)劑形成管道中空部分。要使交聯(lián)劑的離子完全滲透進(jìn)水凝膠需要一定的時(shí)間，取決于交聯(lián)劑離子的濃度、壁厚、海藻酸溶液濃度等。因此，剛擠出的中空細(xì)絲內(nèi)層先被交聯(lián)，而外層未交聯(lián)，利用細(xì)絲未交聯(lián)的外層，實(shí)現(xiàn)細(xì)絲之間的融合。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞C3A(購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC))轉(zhuǎn)移到裝有DMEM培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1 000 r/min的離心條件下離心5 min。舍棄離心后的上清培養(yǎng)液，加入一定量的DMEM培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每48 h換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合后，加入適量0.25%的胰蛋白酶溶液，顯微鏡下觀察細(xì)胞邊界變得清晰時(shí)，從培養(yǎng)皿上分離細(xì)胞。室溫下1 000 r/min離心5 min，舍棄上層清液，然后加入適量完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。將消毒的海藻酸鈉溶液與C3A單細(xì)胞懸液均勻混合，制造海藻酸鈉濃度為6%、細(xì)胞濃度為約106cells/mL的混合液。

1.6 灌流培養(yǎng)

為了驗(yàn)證打印的微通道能用于灌流并為組織內(nèi)部的細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，設(shè)計(jì)了灌流系統(tǒng)，對(duì)含微通道結(jié)構(gòu)的支架進(jìn)行灌流培養(yǎng)。首先，對(duì)打印的支架進(jìn)行了處理，完整的支架模型如圖3(a)所示；其次，對(duì)支架的兩側(cè)進(jìn)行切除，得到的結(jié)構(gòu)如圖3(b)所示，切割后的結(jié)構(gòu)俯視圖和側(cè)視圖如圖3(c)、(d)所示。灌流器的結(jié)構(gòu)如圖4(a)、(b)所示，灌流器主要由氣體交換口、模具、橡膠密封圈、玻璃蓋板、注液口組成。灌流系統(tǒng)原理如圖4(c)所示，將切割后的結(jié)構(gòu)嵌入灌流器的凹槽中，凹槽與切割后的結(jié)構(gòu)大小一致。注射器中吸入細(xì)胞培養(yǎng)基，并與灌流器的注液口通過聚四氟乙烯管連接。利用注射泵進(jìn)行循環(huán)排液和抽液，培養(yǎng)基流過縱向通道，實(shí)現(xiàn)對(duì)縱向微通道的灌流。

圖3 微通道支架的模型。 (a)完整的支架模型；(b)切割后的支架模型；(c)切割后支架俯視圖；(d)切割后支架側(cè)視圖Fig.3 Model of microchannel scaffold. (a)Whole scaffold model；(b)Scaffold that has been cut；(c)Vertical view；(d)Side view

圖4 灌流設(shè)備示意。(a)灌流器透視圖；(b)灌流器側(cè)視圖；(c)灌流系統(tǒng)原理Fig.4 The schematic diagram of the perfusion equipment. (a)Perspective of the perfusion device；(b)Side view of the perfusion device；(c)The schematic diagram of the perfusion system

1.7 細(xì)胞活性檢測(cè)

將肝細(xì)胞封裝進(jìn)海藻酸鈉中進(jìn)行打印。細(xì)胞活死染色劑被用于本次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞生存能力分析，在熒光顯微鏡下觀察染色后的中空細(xì)絲，活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。

2 結(jié)果

使用同軸噴頭制造中空細(xì)絲，海藻酸鈉溶液從外針和內(nèi)針的夾層中擠出，氯化鈣溶液從內(nèi)針中擠出，同軸擠出系統(tǒng)實(shí)物如圖5(a)所示。結(jié)果顯示，濃度2%以下的海藻酸溶液由于濃度較低，中空管道容易坍塌，不利于管道的成形。而濃度7%以上的海藻酸鈉溶液濃度較高，注射泵需要較大的推力才能擠出，導(dǎo)致出現(xiàn)較大的剪切應(yīng)力，不利于細(xì)胞的存活，因此實(shí)驗(yàn)選用的海藻酸鈉濃度為2%～7%。

圖5 中空細(xì)絲的形成。(a)擠出系統(tǒng)實(shí)物；(b)顯微鏡下觀察中空細(xì)絲的內(nèi)徑和外徑；(c)灌流測(cè)試；(d)和(e)液體流過中空細(xì)絲Fig.5 Printed hollow filaments. (a)Extrusion system；(b)The filament under an inverted microscope；(c)Perfusion test；(d)and(e)The liquid flows through the hollow filaments

將中空細(xì)絲放在顯微鏡下觀察(見圖5(b))，細(xì)絲具有光滑統(tǒng)一的內(nèi)腔，管壁厚度均勻，管子內(nèi)徑約為0.64 mm，外徑約為0.92 mm。如圖5(c)所示，利用注射器向中空細(xì)絲中注射藍(lán)色溶液，藍(lán)色溶液順利流過了導(dǎo)管，沒有發(fā)生泄漏和堵塞，圖5(d)、(e)為顯微鏡下觀察到液體流過中空細(xì)絲的過程。

圖6 材料濃度對(duì)細(xì)絲尺寸的影響。(a)氯化鈣溶液濃度對(duì)細(xì)絲尺寸的影響；(b)海藻酸鈉溶液濃度對(duì)細(xì)絲尺寸的影響Fig.6 Effect of concentration on hollow filament size. (a)Effect of concentration of calcium chloride on hollow filament size；(b)Effect of Concentration of sodium alginate on hollow filament size

中空細(xì)絲的尺寸直接影響立體結(jié)構(gòu)的打印效果，因此預(yù)先研究了各制造參數(shù)對(duì)中空細(xì)絲的影響。研究參數(shù)包括海藻酸鈉的擠出速率、海藻酸鈉的濃度、氯化鈣溶液的擠出速率、氯化鈣溶液的濃度等。圖6(a)是使用6%海藻酸鈉溶液和不同濃度氯化鈣溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯化鈣溶液的濃度對(duì)中空細(xì)絲尺寸沒有明顯的影響。圖6(b)是使用4%氯化鈣溶液和不同濃度海藻酸鈉溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著海藻酸鈉濃度的增加，中空細(xì)絲的內(nèi)徑和外徑增加，中空細(xì)絲的壁厚與海藻酸鈉的濃度無明顯關(guān)系。

隨后，研究了海藻酸鈉和氯化鈣溶液的擠出速率對(duì)中空細(xì)絲尺寸的影響。圖7(a)顯示，氯化鈣交聯(lián)劑的流量增加時(shí)，細(xì)絲的內(nèi)徑增加，外徑基本不變，從而產(chǎn)生了更薄的管壁。當(dāng)海藻酸鈉擠出速率小于5 μL/s時(shí)，無法形成中空細(xì)絲。圖7(b)顯示，海藻酸鈉溶液的流量增加時(shí)，細(xì)絲的內(nèi)徑減小，外徑略微增加，從而產(chǎn)生了更厚的管壁。

在3D打印過程中，打印速度應(yīng)與出絲速度相匹配，避免細(xì)絲的堆積或者過度拉伸，有利于中空細(xì)絲的穩(wěn)定成形。因此，研究了材料的擠出速率對(duì)正常出絲速度的影響，如圖7(c)、(d)所示，隨著氯化鈣溶液和海藻酸鈉溶液擠出速率的增加，出絲速度增加，與之匹配的打印速度應(yīng)該隨之增加。

由于較厚的管壁會(huì)阻礙氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，而過薄的壁厚會(huì)影響機(jī)械強(qiáng)度和限制細(xì)胞封裝數(shù)量[30]。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：使用6%的海藻酸鈉和4%的氯化鈣溶液，擠出速率分別為7和3 μL/s時(shí)，能產(chǎn)生較為理想的中空細(xì)絲，此時(shí)中空細(xì)絲的直徑約為0.93 mm，內(nèi)徑約為0.63 mm，壁厚約為0.15 mm，出絲速度約為11 mm/s。

在打印過程中，中空細(xì)絲的交聯(lián)過程從內(nèi)腔逐漸擴(kuò)散到外層，可利用外層未交聯(lián)的海藻酸，使相鄰的細(xì)絲發(fā)生融合。打印絲間距為1 mm的單層結(jié)構(gòu)，相鄰細(xì)絲的融合的結(jié)果如圖8(a)所示。結(jié)果顯示，細(xì)絲之間可以發(fā)生融合，實(shí)現(xiàn)逐層疊加打印。

打印5層層高1 mm、絲間距2.5 mm的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)(50 mm(L)×50 mm(W)×5 mm(H))。對(duì)立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了灌流測(cè)試(見圖8(b))，注射器向微通道中注射的溶液(藍(lán)色)可通過內(nèi)部通道從樣品中流出，過程中無泄漏和堵塞。圖8(c)、(d)為光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)(optical coherence tomography，OCT)對(duì)打印支架的三維掃描，可以看到垂直相交的立體中空管道。圖8(e)為OCT的掃描縱向剖面，可以觀察到打印結(jié)構(gòu)的橫向通道及縱向通道，細(xì)絲的中空結(jié)構(gòu)明顯。

3D細(xì)胞封裝對(duì)比常規(guī)的二維細(xì)胞培養(yǎng)有很多優(yōu)勢(shì)，改進(jìn)了細(xì)胞之間的接觸與細(xì)胞基質(zhì)的交互。因此，制造了封裝有C3A細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)，材料為6%的海藻酸鈉與106cells/mL的C3A細(xì)胞混合液和4%的氯化鈣溶液；打印的細(xì)胞支架尺寸為30 mm(L)×30 mm(W)×4 mm(H)，層高為1 mm，絲間距為1 mm，層數(shù)為4層。

支架打印完成后，在2%的氯化鈣溶液中浸泡15 s使其完全交聯(lián)，在PBS中清洗3次，清除殘留的氯化鈣。對(duì)打印結(jié)構(gòu)兩側(cè)進(jìn)行切除，得到30 mm(L)×15 mm(W)×4 mm(H)的長(zhǎng)方體。將切割后的結(jié)構(gòu)嵌入灌流器(見圖9)中，然后固定好密封玻璃和空氣濾帽。注射器中吸入20 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，灌流器與注射器通過聚四氟乙烯管連接。設(shè)置注射泵進(jìn)行循環(huán)排液和抽液，流量為50 μL/s，每次循環(huán)的體積為5 mL。

圖7 材料的擠出速率對(duì)細(xì)絲的影響。(a)氯化鈣溶液擠出速率對(duì)細(xì)絲尺寸的影響；(b)海藻酸鈉溶液擠出速率對(duì)細(xì)絲尺寸的影響；(c)氯化鈣溶液擠出速率對(duì)出絲速度的影響；(d)海藻酸鈉溶液擠出速率對(duì)出絲速度的影響Fig.7 Effect of flow rate on hollow filament. (a)Effect of calcium chloride flow rate on hollow filament size；(b)Effect of sodium alginate flow rate on hollow filament size；(c)Effect of calcium chloride flow rate on velocity of wire；(d)Effect of sodium alginate flow rate on velocity of wire

圖8 立體結(jié)構(gòu)觀察。(a)顯微鏡下觀察細(xì)絲的融合截面；(b)立體結(jié)構(gòu)的灌流測(cè)試；(c)和(d)OCT三維掃描；(e)OCT掃描縱向剖面Fig.8 The 3D structure. (a)Observe fusion under an inverted microscope；(b)Perfusion test；(c)and(d)Three-dimensional scan by OCT；(e)Cutaway scan by OCT

圖9 灌流系統(tǒng)實(shí)物Fig.9 Perfusion system

圖10 封裝進(jìn)C3A細(xì)胞的中空細(xì)絲。(a)和(b)顯微鏡觀察細(xì)胞分布；(c)和(d)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞存活率Fig.10 C3A cells encapsulated in hollow filaments. (a)and(b)Observe Cell by microscope；(c)and(d) Observe cell survival rate by fluorescence microscope

圖10為常規(guī)培養(yǎng)1 d的中空細(xì)絲染色后在熒光顯微鏡下觀察到的圖像。從圖10(a)、(b)中可以看出，肝細(xì)胞均勻分布在中空細(xì)絲的管壁中；圖10(c)、(d)表明，活細(xì)胞(綠點(diǎn))的數(shù)量遠(yuǎn)大于死亡的細(xì)胞(紅點(diǎn))。

實(shí)驗(yàn)組將灌流器置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，灌流培養(yǎng)期間每24 h更換一次培養(yǎng)基;對(duì)照組將同樣的肝組織置于二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)基。使用細(xì)胞活死染色劑對(duì)支架染色15 min，之后用PBS清洗3次。染色后的支架在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算出細(xì)胞存活率，表示為活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的百分比。

圖11 細(xì)胞存活率變化Fig.11 Cell survival rate after fabricating

培養(yǎng)24、48、72 h后，分別對(duì)灌流培養(yǎng)組和非灌流培養(yǎng)組縱向通道周圍的細(xì)胞進(jìn)行了活性分析。圖11為灌流組和非灌流組細(xì)胞存活率的變化，灌流組的細(xì)胞存活率分別為：24 h后90%±2.8%，48 h后88%±4.1%，72 h后86%±2.7%。非灌流組的細(xì)胞生存率分別為：24 h后88%±2.1%，48 h后83%±4.7%，72 h后70%±3.1%。

3 討論

相比傳統(tǒng)的基于犧牲材料的管道制造方法，基于同軸噴頭的管道制造方法有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：無后處理步驟，對(duì)細(xì)胞損傷小，靈活性較高，能直接生物打印復(fù)雜的介質(zhì)交換網(wǎng)絡(luò)。但此方法也有其局限性，如制造的管道尺寸有限，無法直接生成分叉的管道[30]，等等。

在對(duì)中空細(xì)絲的研究中發(fā)現(xiàn)，同軸噴頭的外針略長(zhǎng)于內(nèi)針，有利于中空細(xì)絲的穩(wěn)定成形。同時(shí)由于外針長(zhǎng)于內(nèi)針，中空細(xì)絲的外徑受到外針的限制，改變材料濃度、材料擠出速率等參數(shù)時(shí)，中空細(xì)絲的外徑變化較小。增加海藻酸鈉的擠出速率時(shí)，增加了單位時(shí)間內(nèi)生物材料的擠出體積，從而產(chǎn)生了更厚的管壁，并增加了出絲速度。增加交聯(lián)劑的擠出速率時(shí)，使交聯(lián)劑對(duì)管壁產(chǎn)生更大的徑向壓力，從而產(chǎn)生了更薄的管壁，并增加了出絲速度。

通過編程打印機(jī)移動(dòng)軸的運(yùn)動(dòng)路徑，使持續(xù)擠出的中空細(xì)絲堆疊成預(yù)期的3D結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)內(nèi)部制造了復(fù)雜的立體通道。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)絲之間能相互融合，對(duì)立體結(jié)構(gòu)的灌流測(cè)試顯示，在打印路徑的拐角處以及層與層之間的連接處，細(xì)絲依舊保持內(nèi)部通道的完整。這表明，此打印方法未來有潛力生成彎曲的血管結(jié)構(gòu)，模擬生物體彎曲的血管。用OCT技術(shù)對(duì)立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，進(jìn)一步清晰地展示了一個(gè)完整互連的內(nèi)部通道。雖然細(xì)絲疊層部位顯示輕微變形，但未出現(xiàn)管道破裂、堵塞等現(xiàn)象。

將肝細(xì)胞封裝進(jìn)海藻酸鈉中進(jìn)行打印，細(xì)絲中的細(xì)胞存活率較高，表明中空細(xì)絲的擠出過程并未對(duì)細(xì)胞造成明顯的損傷。隨后，對(duì)含細(xì)胞的微通道支架進(jìn)行灌流培養(yǎng)，灌流組和非灌流組縱向通道周圍細(xì)胞的生存環(huán)境形成對(duì)比。由于非灌流組中縱向通道內(nèi)的培養(yǎng)基無法充分流動(dòng)，細(xì)胞無法獲得足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；而灌流組的縱向通道內(nèi)的培養(yǎng)基充分循環(huán)流動(dòng)，為細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸和廢棄物排放。因此，灌流組的細(xì)胞存活率高于非灌流組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率差異越來越大。

4 結(jié)論

本研究利用同軸擠出系統(tǒng)制造封裝肝細(xì)胞的中空細(xì)絲，結(jié)合生物3D打印系統(tǒng)，疊層制造含微通道網(wǎng)絡(luò)的肝組織。對(duì)中空細(xì)絲的研究表明，控制材料的濃度和擠出速率可以改變中空細(xì)絲的尺寸和出絲速度。得出較理想的制造參數(shù)為：6%的海藻酸鈉和4%的氯化鈣溶液，擠出速率分別為7和3 μL/s，噴頭移動(dòng)速度為11 mm/s。

疊層制造過程中，中空細(xì)絲之間有效融合，且支架內(nèi)部的立體通道完整。打印過程對(duì)細(xì)胞的損傷小，細(xì)胞存活率較高。灌流組和非灌流組在培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞活性有顯著的差異，證明了對(duì)微通道灌流可以提高微通道周圍肝細(xì)胞的存活率。相比其他管道制造方法，本打印系統(tǒng)有明顯的優(yōu)勢(shì)，未來有較大的潛力用于制造血管化的人工組織。