不同孔徑微孔濾膜富集腫瘤細(xì)胞的方法

趙 霄 劉文娟, 李 磊, 楊水青, 余春紅, 崔寧軒, 王 穎, 易宗春,*

1(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100083)2(北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083)

引言

腫瘤原發(fā)灶或繼發(fā)灶上的腫瘤細(xì)胞，自發(fā)或受外界因素的作用，脫離腫瘤組織進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)，經(jīng)過血液循環(huán)到達(dá)人體別的組織或器官，形成新的腫瘤灶，這些存在于血液中的腫瘤細(xì)胞即為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)[1]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)癌癥的早期檢測(cè)、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估及個(gè)性化治療等有著重要意義[2]。但是，由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中含量很少，與白細(xì)胞、紅細(xì)胞相差懸殊[3]，這又給循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)帶來極大的困難與挑戰(zhàn)，因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集就非常重要。

現(xiàn)有的富集方法主要包括免疫磁分離法、梯度離心法、微流控技術(shù)以及膜濾過分離法等。但是，前兩種富集方法假陽性假陰性高、敏感性差；微流控技術(shù)靈敏度較高，但成本高；而基于細(xì)胞大小的膜濾過分離技術(shù)與微流控原理類似，具有操作簡單、檢測(cè)成本低、敏感性高等特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中極具優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)有的針對(duì)膜過濾富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法多采用8 μm濾膜[4]，對(duì)于8 μm以下濾膜的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可穿過孔徑比其自身直徑小很多的濾膜[5]，因此筆者進(jìn)一步研究多種濾膜孔徑與腫瘤細(xì)胞回收率之間的關(guān)系，以探索更理想的膜過濾富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞方法。

1 方法

1.1 材料和儀器

K562細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)，可換膜過濾器(北京凱樂思公司)，不同孔徑(1、3、5、8、10 μm)聚碳酸酯微孔濾膜(北京升河濾膜公司)，10 mL注射器(上海治寧公司)，IX熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，DT5-1離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)，4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)，結(jié)晶紫溶液(北京鼎國盛公司)，紅細(xì)胞裂解液(北京凱樂思科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞在含有10% FBS、100U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2甲醛固定及結(jié)晶紫染色

取指數(shù)生長期的K562細(xì)胞，每毫升加入1 mL的4%多聚甲醛固定液，室溫固定15 min后，PBS洗滌3次。使用500 μL結(jié)晶紫染色液染色10 min，PBS洗滌3次，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞濾過率的測(cè)定

活性及固定的K562細(xì)胞濾過率的測(cè)定：分別取濃度為7.2×105～7.4×105/mL的活性的K562細(xì)胞及固定后的K562細(xì)胞200 μL，通過1、3、5、8、10 μm微孔濾膜。

1 mL血液濾過率的測(cè)定：分別取1 mL靜脈血與裂解液按照1:10的比例混勻，8 min后離心洗滌，再通過1、3、5、8、10 μm微孔濾膜；重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算每個(gè)樣本濾過率：活性K562細(xì)胞濾過率(%)=回收液中活性K562細(xì)胞個(gè)數(shù)/實(shí)際所加活性K562細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%，固定K562細(xì)胞濾過率(%)=回收液中固定K562細(xì)胞個(gè)數(shù)/實(shí)際所加固定K562細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%，1 mL血液的濾過率(%)=回收液中白細(xì)胞個(gè)數(shù)/實(shí)際所加1 mL血液中白細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

1.2.4細(xì)胞回收率及陽性率測(cè)定

將固定染色的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，稀釋后取少量加入96孔板中，靜止2 h后，在顯微鏡下找出10個(gè)只含有1個(gè)細(xì)胞的孔。1～10個(gè)目標(biāo)細(xì)胞按照如上方法配置。將不同孔徑的濾膜安裝至可換膜過濾器中，將含有目標(biāo)細(xì)胞的液體吸入過濾裝置中，并用1 mL PBS清洗。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算每個(gè)樣本的回收率及陽性率：回收率(%)=濾膜上的固定K562細(xì)胞數(shù)之和/實(shí)際所加固定K562細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%，陽性率(%)=濾膜上出現(xiàn)固定K562細(xì)胞的樣本個(gè)數(shù)/總樣本數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用方差分析法來分析各組間的差異，兩組間差異用t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，error bars采用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

活性K562細(xì)胞、固定K562細(xì)胞及血液通過不同孔徑的微孔濾膜濾過率及時(shí)間的結(jié)果如圖1所示?；钚约肮潭↘562細(xì)胞通過1、3、5、8、10 μm微孔濾膜后(見圖1(a))，隨著濾膜孔徑增大，濾過率逐漸增大，活性的K562細(xì)胞濾過率明顯大于固定后的K562?；钚訩562細(xì)胞及固定染色后的K562細(xì)胞均可穿過5、8、10 μm濾膜，不能穿過1 μm濾膜，固定K562細(xì)胞不能穿過3 μm濾膜。同時(shí)，將1 mL血液樣本分別通過1、3、5、8、10 μm微孔濾膜，如圖1(a)所示，8和10 μm的濾過率為64%左右，1、3、5 μm濾膜的濾過率分別為0%、16.48%、44.23%。固定K562細(xì)胞過濾時(shí)濃度與時(shí)間的關(guān)系如圖1(b)所示。使用不同濃度固定染色的K562細(xì)胞，分別通過1和3 μm濾膜，相同條件下，使用1 μm濾膜的過濾時(shí)間顯著性大于3 μm濾膜過濾的時(shí)間顯著性(P<0.01)。

不同條件下目標(biāo)細(xì)胞通過3 μm濾膜后回收率的結(jié)果如圖2所示。將1～10個(gè)固定染色的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，分別在未混入細(xì)胞、混入5×105個(gè)活性K562細(xì)胞、混入1×106個(gè)活性K562細(xì)胞、混入1 mL血液后，通過3 μm濾膜過濾，測(cè)得回收率(見圖2)。目標(biāo)細(xì)胞未混任何細(xì)胞，平均回收率可達(dá)60%～70%；目標(biāo)細(xì)胞混5×105個(gè)活性K562，平均回收率在45%～60%之間；目標(biāo)細(xì)胞混1×106個(gè)活性K562，平均回收率在40%～55%之間；目標(biāo)細(xì)胞混入1 mL血液，平均回收率在40%～65%之間?；炝嘶钚訩562的樣本進(jìn)行過濾時(shí)，對(duì)1～10個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的富集影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；混了血液的樣本進(jìn)行過濾時(shí)，對(duì)2、4、10個(gè)目標(biāo)細(xì)胞富集的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。總之，目標(biāo)細(xì)胞在不同樣本溶液中，回收率具有一定差異。

圖1 活性、固定K562細(xì)胞及血液樣本通過不同孔徑的微孔濾膜濾過率及時(shí)間。(a)活性K562細(xì)胞、固定K562細(xì)胞及血液樣本通過不同規(guī)格濾膜后的濾過率；(b)1和3 μm濾膜過濾的固定K562細(xì)胞濃度與時(shí)間的關(guān)系(**表示P<0.01)Fig.1 The filtration rate and time of K562 cells(live and fixed)and 1 ml blood cells through microporous filter membranes with different pore sizes. (a) The filtration rate of live K562 cells, fixed K562 cells and blood cells through different filter membranes; (b) The relationship between concentration and time of fixed K562 cells filtered by 1 μm and 3 μm filters. Meanwhile, t-test has been used(** indicates P<0.01)

圖2 不同條件下目標(biāo)細(xì)胞通過3 μm濾膜后的回收率Fig.2 The recovery rate of target cells through 3 μm filter membrane under different conditions

不同條件下目標(biāo)細(xì)胞通過3 μm濾膜后陽性率的結(jié)果如圖3所示。將1～10個(gè)固定染色的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，分別在未混入細(xì)胞、混入5×105個(gè)活性K562細(xì)胞、混入1×106個(gè)活性K562細(xì)胞、混入1 mL血液后，通過3 μm濾膜過濾，測(cè)得陽性率如圖3所示。目標(biāo)細(xì)胞未混任何細(xì)胞，目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)為2時(shí)陽性率為90%，目標(biāo)數(shù)為4及以上時(shí)陽性率可達(dá)100%；目標(biāo)細(xì)胞混入5×105個(gè)活性K562，目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)為2時(shí)陽性率為73.33%，目標(biāo)數(shù)為4及以上時(shí)陽性率可達(dá)100%；目標(biāo)細(xì)胞混入1×106個(gè)活性K562，目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)為2時(shí)陽性率為66.67%，目標(biāo)數(shù)為4時(shí)陽性率為93.33%，目標(biāo)數(shù)為6及以上時(shí)陽性率可達(dá)100%；目標(biāo)細(xì)胞混入1 mL血液，目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)為2時(shí)陽性率為77%，目標(biāo)數(shù)為4及以上時(shí)陽性率可達(dá)100%?；烊牖钚訩562細(xì)胞后會(huì)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞富集的產(chǎn)生影響，混入細(xì)胞越多陽性率越低；混入血液后測(cè)得的陽性率大于混活性K562細(xì)胞的陽性率。在細(xì)胞個(gè)數(shù)為6及以上時(shí)，陽性率均可達(dá)到100%。

圖3 不同條件下目標(biāo)細(xì)胞通過3 μm濾膜后的陽性率Fig.3 The positive rate of target cells through 3 μm filter membrane under different conditions

3 討論

實(shí)際臨床循環(huán)腫瘤細(xì)胞的大小在10 μm以上，而固定的K562細(xì)胞的直徑約為12 μm，活性的K562細(xì)胞約為13 μm[5]，K562細(xì)胞與其他細(xì)胞系相比直徑較小，但也在10 μm以上，因此本實(shí)驗(yàn)采用與實(shí)際腫瘤細(xì)胞的大小相差不多的K562細(xì)胞進(jìn)行富集的研究，從而可以更好地選出一種合適孔徑的濾膜，以去除直徑較小的白細(xì)胞，保留直徑較大的腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)活性和固定的K562及血液通過不同微孔濾膜的濾過率，選出1 μm及 3 μm孔徑濾膜用于腫瘤細(xì)胞的富集，同時(shí)結(jié)合1 μm與3 μm濾膜在過濾細(xì)胞的時(shí)間效率，進(jìn)一步確定了3 μm的微孔濾膜富集腫瘤細(xì)胞系。

接下來，在模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集的實(shí)驗(yàn)過程中，使用多聚甲醛固定的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，用以模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞。臨床上對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集與檢測(cè)，有對(duì)活細(xì)胞的，也有對(duì)固定細(xì)胞的。Chen等使用一種微橢圓形過濾器，對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者、非小細(xì)胞肺癌患者、結(jié)腸癌患者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(活性)進(jìn)行了富集[6]；吳源娜等使用基于膜過濾分離技術(shù)的CTC-BIOPSY@，對(duì)胃癌患者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(固定)進(jìn)行了富集[7]。筆者在后續(xù)研究臨床樣本時(shí)，將會(huì)對(duì)樣本進(jìn)行固定，對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行富集，因此使用多聚甲醛固定的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，用以模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞。經(jīng)多聚甲醛固定后的K562與活性K562細(xì)胞相比，形態(tài)特征無差異，均為圓球形；活性的K562彈性更大，更容易穿過微孔濾膜，而固定的K562穩(wěn)定性增強(qiáng)，硬度增加，較難通過微孔濾膜。

Coumans等在對(duì)相對(duì)直徑較大的細(xì)胞(MDA-466,直徑14.9 μm；MDA-231，直徑15.4 μm)進(jìn)行過濾時(shí)，通過5 μm孔徑的氮化硅微篩過濾的回收率約為25%和37%[8]，接下來將1～10個(gè)染色固定后的K562細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行富集研究，回收率在60%～70%，某些細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)回收率呈上升趨勢(shì)。目標(biāo)個(gè)數(shù)為2時(shí)陽性率為90%，4個(gè)細(xì)胞及以上陽性率可達(dá)100%，證明實(shí)驗(yàn)的可行性。將目標(biāo)細(xì)胞混入5×105個(gè)活性K562細(xì)胞及1×106個(gè)活性K562細(xì)胞時(shí)，整體上回收率及陽性率均比為混入任何細(xì)胞時(shí)有所降低，但回收率仍在50%左右，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞數(shù)為6個(gè)及以上時(shí)，陽性率為100%。

Hofman等使用膜過濾分離技術(shù)檢測(cè)病人樣本的的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，陽性率約為50%[9]。本實(shí)驗(yàn)回收率在40%～65%之間，目標(biāo)細(xì)胞為2個(gè)細(xì)胞時(shí)陽性率為76.67%，細(xì)胞個(gè)數(shù)為4時(shí)陽性率為100%，說明當(dāng)血液樣本較少時(shí)，使用3 μm的濾膜來富集全血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞是值得嘗試的。將目標(biāo)細(xì)胞混入1 mL血液中，待紅細(xì)胞裂解后，即可用3 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾，相比利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的富集方法操作簡單，同時(shí)避免了由于腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物帶來的假陽性或假陰性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究活性K562細(xì)胞、固定K562細(xì)胞及血液樣本通過微孔濾膜的濾過情況，選取孔徑為3 μm的聚碳酸酯濾膜來完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集，同時(shí)檢測(cè)不同條件下固定的腫瘤細(xì)胞通過3 μm微孔濾膜的回收率及陽性率，為今后的臨床腫瘤患者血液樣本通過微孔濾膜富集并檢測(cè)CTC提供了可行性的研究。但是，考慮到每毫升血液中CTC含量較少，僅為1～10個(gè)，而人體外周血來源容易，因此在完成實(shí)際臨床樣本檢測(cè)時(shí)，可考慮檢測(cè)較大量的樣本，比如3 mL血樣，增加檢出的回收率及陽性率，進(jìn)一步確立從外周血富集回收腫瘤細(xì)胞的方法。