消化時(shí)間對魚肉中囊蚴分離提純效果的影響研究*

張鳳玉 杜鳳霞 劉 柳 王曉琳 劉亭亭 張 浩

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

因生食或半生食含有感染期寄生蟲的食物而感染的寄生蟲病，稱為食源性寄生蟲病(Chaietal., 2012)。食源性寄生蟲病目前在世界范圍流行廣泛，危害嚴(yán)重(Toledoetal., 2012; Fairweatheretal., 2020)。據(jù)Sripa等(2010)的報(bào)道，東南亞的食源性吸蟲病，包括支睪吸蟲病和后睪吸蟲病，約有4 000萬人感染，7.5億人受到威脅，超過世界總?cè)丝诘?0%。隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣逐漸多樣化，食源性吸蟲病已成為威脅人們身體健康的公共衛(wèi)生隱患(Fürstetal.,2012; Yangetal., 2019)。我國淡水資源豐富，魚類品種繁多，魚體內(nèi)寄生有多種不同類型的吸蟲囊蚴(黃安安等, 2015; Yangetal., 2019)。魚體內(nèi)囊蚴的分離檢測對于這類寄生蟲病的預(yù)防與控制具有重要意義。通常魚肉內(nèi)囊蚴的分離多采用人工消化法，對消化時(shí)間有不同報(bào)道(蔣峰等, 2018; Woonetal., 2018)，但對不同消化時(shí)間分離囊蚴的效果少有詳細(xì)比較。為獲取純凈囊蚴，篩選適宜條件，我們對不同時(shí)間消化魚肉獲得的囊蚴進(jìn)行計(jì)數(shù)和比較觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從市場分3批次采集淡水魚，帶回實(shí)驗(yàn)室檢查。實(shí)驗(yàn)次數(shù)為3次。

1.2 直接壓片法

從魚的背部、尾部、腹部各取綠豆大小的一塊肌肉置于兩張載玻片之間，用力擠壓，使魚肉呈半透明薄霧狀，鏡下查找活動囊蚴，任一部位發(fā)現(xiàn)即為陽性。

1.3 人工消化法

將陽性魚去頭、尾和內(nèi)臟，沖洗干凈攪碎后將所有陽性魚混勻分4份，每份取25 g。按1∶10(W/V)的比例放入含有人工消化液的燒杯內(nèi)，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，消化過程中玻璃棒攪拌3～4次。人工消化液按照胃蛋白酶7 g(1∶3 000)、濃鹽酸8 mL、生理鹽水1 000 mL進(jìn)行配置。分別消化4、8、12、16 h后取出燒杯，水洗沉淀后留取沉渣，顯微鏡鏡檢囊蚴。參照文獻(xiàn)和專著對囊蚴形態(tài)進(jìn)行初步鑒別(Tang,2005; Chenetal., 2017)。

圖1 魚肉消化后的沉渣(40×)Fig.1 Sediment after digestion of fish (40×)消化時(shí)間 a：4 h; b：8 h; c: 12 h; d: 16 h。 Digestion time a：4 h; b：8 h; c: 12 h; d: 16 h.

表1 25 g魚肉消化不同時(shí)間含有的囊蚴數(shù)Tab.1 The number of metacercaria in 25 g fish meat digested for different time

1.4 囊蚴計(jì)數(shù)及活力判斷

將沉渣離心后保留沉淀物與上清液共5 mL，吸管吸取沉渣及囊蚴。用加樣槍吸取50 μL沉淀物于載玻片上，鏡下計(jì)數(shù)沉淀物內(nèi)的囊蚴。在顯微鏡下持續(xù)觀察1 min，囊蚴內(nèi)幼蟲有伸縮活動即為存活蟲體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同實(shí)驗(yàn)次數(shù)不同時(shí)間獲取的囊蚴數(shù)采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 沉渣背景

消化4 h的沉渣液體渾濁、顆粒粗大、塊狀絮狀物較多，囊蚴不易分辨、吸取(圖1-a)；消化8、12、16 h的沉渣液體整體較澄清，顆粒偏小且少，囊蚴周圍視野清晰，易分離和收集(圖1b-d)。

2.2 囊蚴分離效果

人工消化液對魚肉消化4、8、12、16 h獲取的囊蚴數(shù)目不等，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.414,P<0.05)。三次實(shí)驗(yàn)，在魚肉消化8 h獲得的囊蚴數(shù)目最多，分別為33.0、36.0、30.0個，平均含有囊蚴(33.0±3.00)個。魚肉消化8 h分別與消化4 h平均(14.0±1.53)個、16 h(19.0±4.04)個囊蚴比較，兩者之間差異顯著(P<0.05)，但與消化12 h比較，二者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯。魚肉消化4 h獲得的囊蚴平均數(shù)最少，50 μL沉渣平均含有囊蚴(14.0±1.53)個，見表1。

圖2 囊蚴活體(400×)Fig.2 Live metacercaria(400×) a: 華支睪吸蟲囊蚴；b：東方次睪吸蟲囊蚴；c：臺灣次睪吸蟲囊蚴。a: Clonorchis sinensis；b: Metorchis orientails c: Metorchis taiwanensis.

2.3 囊蚴形態(tài)和活性

魚肉消化4、8、12、16 h所得囊蚴皆有活性。華支睪吸蟲Clonorchissinensis囊蚴(圖2-a)：呈橢圓形或圓形，囊壁兩層，透明，外壁較厚，內(nèi)壁較薄，口腹吸盤大小相近，排泄囊呈“O”形，囊內(nèi)充滿黑褐色顆粒，幼蟲迂曲在囊壁內(nèi)，間斷性蠕動。東方次睪吸蟲Metorchisorientalis囊蚴(圖2-b)：呈橢圓形或圓形，與華支睪吸蟲囊蚴形態(tài)極其相似，只是囊壁厚度有區(qū)別，近似相同大小的口腹吸盤，幼蟲在囊內(nèi)間斷性蠕動，“O”形排泄囊。臺灣次睪吸蟲Metorchistaiwanensis囊蚴(圖2-c)：呈圓形，雙層囊壁，囊壁厚且透明，排泄囊呈“O”形，口腹吸盤大小相近，囊內(nèi)充滿黃褐色顆粒。

3 討論

食源性吸蟲病主要分布在亞州東北部、中國以及南美等地區(qū)(Liuetal., 2014；Wuetal., 2017)。以魚為媒介的食源性吸蟲病種類較多，在中國東北、沿海地區(qū)均有報(bào)道(Qiuetal., 2017; 謝賢良等, 2019)。淡水魚體內(nèi)吸蟲囊蚴的分離采用胃蛋白酶消化法比較普遍，曾有研究者用生理鹽水配制的消化液對魚肉消化3、6、16 h進(jìn)行過比較觀察，認(rèn)為獲得的囊蚴數(shù)基本相似(陳錫慰等, 1984)。我們在前期工作基礎(chǔ)上，通過延長時(shí)間對魚肉進(jìn)行消化，觀察囊蚴分離的效果，得到消化8 h獲取的囊蚴數(shù)目最多，且各個時(shí)間段都能分離到活性良好的囊蚴。魚肉消化12 h獲得的囊蚴平均數(shù)為27個，僅次于8 h獲得的囊蚴數(shù)，因此消化時(shí)間設(shè)置在8～12 h不僅能夠獲得較好的分離效果還能節(jié)約時(shí)間成本，同時(shí)避免出現(xiàn)消化時(shí)間過少導(dǎo)致囊蚴提取困難、分離效果差等情況。魚肉消化4 h獲得的囊蚴平均數(shù)最少，50 μL沉渣平均含有囊蚴14個，也許跟魚肉消化時(shí)間不充足，部分囊蚴被魚肉遮掩無法觀察有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)，淡水魚體內(nèi)獲得3種吸蟲囊蚴，與以往文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合，說明本地區(qū)存在多種食源性吸蟲病的可能(劉繼鑫等, 2014; 黃安安等, 2015) 。淡水魚體內(nèi)吸蟲囊蚴的存在也提示人們在日常生活中應(yīng)養(yǎng)成良好的飲食習(xí)慣，可以從源頭上控制食源性吸蟲病流行(Tangetal., 2016; 蔣峰等, 2018; 孫青松等, 2019)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)和專著對囊蚴形態(tài)進(jìn)行初步鑒別，在后期實(shí)驗(yàn)中將采用分子測序方法進(jìn)行囊蚴種類鑒定；本實(shí)驗(yàn)?zāi)因驶钚詼y定上僅以鏡下觀察囊內(nèi)幼蟲活動時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步采用后蚴孵化法進(jìn)行驗(yàn)證。