塞來昔布聯(lián)合吉西他濱動(dòng)脈灌注抑制人肺癌A549細(xì)胞移植瘤的研究

何 陽，趙保成，劉洪強(qiáng)，王賽博，鄭曉輝，曹 軍

(上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院，上海 200237)

塞來昔布聯(lián)合吉西他濱動(dòng)脈灌注抑制人肺癌A549細(xì)胞移植瘤的研究

何 陽，趙保成，劉洪強(qiáng)，王賽博，鄭曉輝，曹 軍

(上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院，上海 200237)

目的研究塞來昔布聯(lián)合吉西他濱經(jīng)動(dòng)脈灌注抑制人肺癌A549細(xì)胞移植瘤的作用。方法人肺癌A549細(xì)胞系經(jīng)傳代培養(yǎng)后，移植于40只祼大鼠建立肺癌裸大鼠模型。將荷瘤鼠均分為假手術(shù)組、吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組。假手術(shù)組動(dòng)脈注入生理鹽水0.2 mL。吉西他濱組、塞來昔布組分別經(jīng)動(dòng)脈灌注吉西他濱100 mg/kg及塞來昔布25 mg/kg。聯(lián)合組灌注吉西他濱100 mg/kg+塞來昔布25 mg/kg。觀察干預(yù)前后各組大鼠腫瘤體積的變化，計(jì)算荷瘤鼠的抑瘤率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，采用Western blot法檢測(cè)各組Bcl-2以及Caspase-3表達(dá)情況。結(jié)果吉西他濱組、塞來昔布組和聯(lián)合組的抑瘤率分別為54.18%，49.52%和88.59%；聯(lián)合組移植瘤組織的Bcl-2表達(dá)量均低于其他3組(P均<0.05)，Caspase-3表達(dá)量及凋亡指數(shù)均高于其他3組(P均<0.05)。結(jié)論塞來昔布與吉西他濱動(dòng)脈灌注都能抑制肺癌裸大鼠移植瘤的生長(zhǎng)，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更好，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是兩者協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制。

塞來昔布；吉西他濱；動(dòng)脈灌注化療；肺癌

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，肺癌患者5年的生存率僅為16.1%，在癌癥死亡患者中肺癌是男性第一死亡因素，是女性第三死亡因素，因此積極探尋有效的治療方式成為研究重點(diǎn)[1]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)不僅能夠促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管形成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，而且對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及將前致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)有主導(dǎo)作用。動(dòng)物試驗(yàn)表明，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布灌胃可抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[2]。還有試驗(yàn)報(bào)道，第三代化療藥吉西他濱應(yīng)用于中晚期肺癌的介入化療中，不僅能夠直接殺滅惡性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)可抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮間接抗腫瘤作用，且近期有效率高于第三代靜脈化療方案[3]。但是關(guān)于塞來昔布聯(lián)合吉西他濱動(dòng)脈灌注抑制人肺癌A549 細(xì)胞移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究尚少見，為此筆者以體外實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了研究，旨在為今后從分子角度采用此種方式治療肺癌奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料 人肺癌A549(上海市腫瘤研究所)。SPF級(jí)裸大鼠40只、BALB/C裸小鼠4只(北京智鼠多寶公司)，動(dòng)物合格證SYXK(滬)2007-0001，裸大鼠體質(zhì)量(180±15)g，8～10周齡，雌雄各半；裸小鼠體質(zhì)量(22.1±2.1)g，4～5周齡，雌雄各半。飼養(yǎng)相對(duì)濕度40%～50%，溫度22～25 ℃，攝食、飲水自由同等。塞來昔布(輝瑞公司)，吉西他濱(豪森藥業(yè))。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海炎彬化工科技有限公司)；ECL試劑盒(BestBIO 公司)，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3，B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2，GAPDH 抗體(Santa cruz)，鼠抗人二抗(碧云天)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺癌A549細(xì)胞復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化、離心，收集細(xì)胞用1 mL冰PBS稀釋成5×106mL-1，以0.2 mL接種于4只BALB/C裸小鼠右腋皮下(因?yàn)槁阈∈蠼臃N成瘤容易，直接用肺癌細(xì)胞株接種裸大鼠成瘤困難，所以先接種裸小鼠，取得足夠量腫瘤組織)，待腫瘤長(zhǎng)至體積約為10 mm×10 mm×10 mm時(shí)移植于裸大鼠耳后造模。

1.2.2造模分組 將瘤結(jié)無破潰、生長(zhǎng)良好的腋下接種荷瘤裸小鼠4只處死，無菌條件下剝離瘤結(jié)，清除壞死組織，在生理鹽水中將瘤結(jié)反復(fù)剪切為2 mm×2 mm×2 mm大小的瘤組織塊，然后接種于裸大鼠右耳后皮下。腫瘤于8 d后接種成功，腫瘤生長(zhǎng)3周后體積2 650～2 800 mm3，對(duì)荷瘤裸大鼠根據(jù)性別分層后分為假手術(shù)組、吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組，每組10只。

1.2.3給藥方法 用10%水合氯醛3.5 g/kg腹腔麻醉各組荷瘤大鼠，頸部正中皮膚切開，暴露右頸動(dòng)脈；采用改良Seldinger技術(shù)將靜脈留置針插入右頸動(dòng)脈，先在C臂機(jī)DSA下使用稀釋的碘克沙醇0.2 mL行手推動(dòng)脈造影，診斷腫瘤的供血?jiǎng)用}并明確腫瘤的顯影情況；再經(jīng)導(dǎo)管灌注藥物或鹽水，緩慢推注，灌注時(shí)間30 s，隨后縫合皮膚。假手術(shù)組經(jīng)導(dǎo)管注入生理鹽水0.2 mL，吉西他濱組予吉西他濱100 mg/kg導(dǎo)管灌注，塞來昔布組予塞來昔布25 mg/kg導(dǎo)管灌注，聯(lián)合組予吉西他濱100 mg/kg、塞來昔布25 mg/kg導(dǎo)管灌注。

1.2.4腫瘤體積及抑瘤率測(cè)量方法 采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，腫瘤體積(mm3)=腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2/2。用藥后第16天處死各組大鼠，取出皮下腫瘤稱質(zhì)量，抑瘤率 =(1-藥物組瘤質(zhì)量/荷瘤假手術(shù)組瘤質(zhì)量)×100%。計(jì)算Q值并判斷兩藥的聯(lián)合效應(yīng)[4]：若E(A+B)設(shè)為兩藥聯(lián)用抑瘤率，EA和EB為各單藥抑瘤率，則Q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB]，Q值0.85～1.15提示兩藥作用相加，Q>1.15提示兩藥協(xié)同， Q<0.85提示兩藥拮抗。

1.2.5組織檢測(cè) 取新鮮瘤組織，用10%甲醛溶液固定后，將腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，離心去除細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞(每組至少1×106個(gè)細(xì)胞)，按Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡率。蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞形態(tài)；Western blot法檢測(cè)Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平：SDS-PAGE分離膠電泳；4%SDS-PAGE濃縮膠電泳。PVDF膜半干轉(zhuǎn)100 V，30 min。5%脫脂奶粉封閉過夜。一抗1∶1 000過夜，二抗1∶5 000孵育1 h。按操作試劑盒說明操作。

2 結(jié) 果

2.1裸大鼠情況 40只裸大鼠實(shí)驗(yàn)完成時(shí)均存活，飲水、進(jìn)食、活動(dòng)狀態(tài)良好，各組手術(shù)切口愈合好，均未見感染。

2.2各組荷瘤鼠腫瘤體積比較 各組移植瘤治療前體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。治療后，吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組腫瘤體積均小于假手術(shù)組(P均<0.05)，吉西他濱組腫瘤體積小于塞來昔布組(P均<0.05)，聯(lián)合組小于吉西他濱組和塞來昔布組(P均<0.05)。見表1。

表1 治療前后各組荷瘤鼠腫瘤體積比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與聯(lián)合組比較，P<0.05；③與塞來昔布組比較，P<0.05。

2.3各組移植瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)， 聯(lián)合組明顯低于吉西他濱組、塞來昔布組(P均<0.05)；聯(lián)合組抑瘤率明顯高于吉西他濱組、塞來昔布組，其Q值>1.15。見表2。

2.4各組Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)情況 假手術(shù)組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.20±0.09，吉西他濱組為0.67±0.15，塞來昔布組為0.80±0.07，聯(lián)合組為0.26±0.08， 聯(lián)合組Bcl-2表達(dá)量明顯低于其余3組(P均<0.05)，吉西他濱組及塞來昔布組明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)。假手術(shù)組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.53±0.05，吉西他濱組為0.99±0.06，塞來昔布組為0.87±0.03，聯(lián)合組為1.46±0.18，吉西他濱組及塞來昔布組Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，聯(lián)合組Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于其余3組(P均<0.05)。

表2 各組移植瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與聯(lián)合組比較，P<0.05。

2.5各組腫瘤組織HE染色表現(xiàn) 假手術(shù)組未見明顯細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，見圖1；吉西他濱組可見凋亡細(xì)胞致密濃縮核染色質(zhì)，凋亡小體形成，核碎裂，可見較多空泡，見圖2；塞來昔布組可見相應(yīng)的凋亡表現(xiàn)，見圖3；聯(lián)合組上述核碎裂及空泡更加明顯，見圖4。

圖1 假手術(shù)組HE染色表現(xiàn)(×200倍)

圖2 吉西他濱組HE染色表現(xiàn)(×200倍)

圖3 塞來昔布組HE染色表現(xiàn)(×200倍)

2.6各組移植瘤細(xì)胞凋亡率比較 移植瘤細(xì)胞凋亡率假手術(shù)組為(4.0±1.4)%，吉西他濱組為(8.9±1.9)%，塞來昔布組為(10.5±2.7)%，聯(lián)合組為(24.5±6.1)%，吉西他濱組、塞來昔布組腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，聯(lián)合組凋亡率明顯高于其余3組(P均<0.05)。

圖4 聯(lián)合組HE染色表現(xiàn)(×200倍)

3 討 論

肺癌中約85%為非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)，就診時(shí)多數(shù)患者為Ⅲ～Ⅳ期[5]。關(guān)于肺癌發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，多數(shù)研究認(rèn)為，瘤內(nèi)血管密度與肺癌的預(yù)后密切相關(guān)，血管形成是腫瘤具有惡性特征的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等宿主細(xì)胞均能釋放多種因子而誘導(dǎo)血管形成。目前研究還認(rèn)為，炎癥是肺癌及其他惡性腫瘤形成的關(guān)鍵因素，在成人腫瘤患者中有25%以上是由炎癥引起的[6]。其中COX-2是目前已知的肺癌促炎因子之一，同時(shí)也是誘導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移的核心調(diào)控分子之一。COX-2基因主要定位于1號(hào)染色體的1q25.2～25.3,大約有8.3kb，編碼604個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，而關(guān)于COX-2表達(dá)的調(diào)控主要是通過刺激細(xì)胞，然后經(jīng)過一系列信號(hào)傳導(dǎo)并作用在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)而誘導(dǎo)COX的表達(dá)，而其中的刺激因素主要有生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及炎癥遞質(zhì)和促癌劑等[7]。

基于腫瘤依賴于血管生成這一病理基礎(chǔ)，抗血管生成化療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。吉西他濱作為新的抗代謝類抗癌藥物，其主要作用在DNA合成期和晚G1期，同時(shí)可阻止細(xì)胞從G1期到S期；其不僅能夠直接殺滅惡性腫瘤細(xì)胞，而且可抑制腫瘤新生血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[8]。

鑒于COX-2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)COX-2的過度表達(dá)不僅不利于腫瘤的治療，同時(shí)也將會(huì)是腫瘤耐藥的相關(guān)機(jī)制。因此提出COX抑制劑可能會(huì)提高腫瘤治療的敏感性，且對(duì)抑制腫瘤新生血管的生成有一定作用。目前多數(shù)試驗(yàn)研究已證實(shí)，COX-2抑制劑能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、微血管生成及誘導(dǎo)凋亡等作用抑制腫瘤生長(zhǎng)。Hida等[9]研究發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑對(duì)化療有增敏作用，選擇性COX-2抑制劑JET-522可降低多種抗腫瘤藥物包括多西紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱等對(duì)肺癌細(xì)胞的IC50，最多可達(dá)70%。塞來昔布是新一代高效COX-2選擇性抑制劑，可通過多條途徑有效地抑制宮頸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[10-11]。有研究表明裸鼠胰腺癌移植瘤可被塞來昔布和吉西他濱聯(lián)合抑制[12]。

局部動(dòng)脈灌注介入治療是近年發(fā)展起來的一種新的治療方式，此種治療方式不僅能夠使無法實(shí)施手術(shù)切除腫瘤患者可以重新手術(shù)切除，同時(shí)對(duì)縮小癌組織體積、降低手術(shù)難度也具有顯著作用。由于肺癌組織主要由支氣管動(dòng)脈供血，局部動(dòng)脈灌注介入治療可使腫瘤組織的藥物濃度達(dá)到靜脈給藥的48倍，從而提高化療藥物的治療作用。

A549細(xì)胞裸大鼠肺癌模型便于行動(dòng)脈插管及介入實(shí)驗(yàn)，成瘤率高，可重復(fù)性好[13]。在此模型的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱與塞來昔布動(dòng)脈給藥后均能抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)凋亡蛋白Caspase-3 的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，其中聯(lián)合組效果更為明顯。兩者聯(lián)用可能是通過上調(diào)Caspase-3表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)A549細(xì)胞移植瘤凋亡，為二者在肺癌介入灌注治療的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Inhibiting effect of arterial perfusion of Celecoxib combined with Gemcitabine on A549 Cell Lines Xenograft

HE Yang, ZHAO Baocheng, LIU Hongqiang,WANG Saibo, ZHENG Xiaohui, CAO Jun

(Dahua Hospital of Xuhui District, Shanghai 200237, China)

Objective It is to compare the inhibiting effect on human lung adenocarcinoma who were treated with celecoxib combined with gemcitabine through arterial perfusion. Methods Human lung adenocarcinoma derived A549 cells were transplanted into 40 BALB/c-nu mice to establish lung cancer model. The models were divided into 4 groups: animals in sham operation group (A group)were treated with normal saline via arterial route, animals arterial perfusion with gemcitabine(B group) were treated with gemcitabine 100 mg/kg, animals arterial perfusion with celecoxib(C group) were treated with celecoxib 25 mg/kg, animals arterial perfusion with gemcitabine and celecoxib(D group)were treated with gemcitabine 100 mg/kg and celecoxib 25 mg/kg.Then dynamical change of tumor volume and tumor inhibiting rate were assessed , the inhibition rate was calculated，cell apoptosis was detected by flow cytometry,and Bcl-2 and Caspase 3 expressions were investigated using western blot. Results The inhibition rate of A group B group and C group were 54.18%,49.52% and 88.59%. Expression of Bcl-2 in lung adenocarcinoma of D group was lower than other three group(P<0.05)，while expression of Caspase-3 was up regulated. Apoptotic index of lung adenocarcinoma of D group were higher than other three groups,Transplanted tumors in arterial and intravenous chemotherapy group(P<0.05). Conclusion Human lung adenocarcinoma can be inhibited by celecoxib combined with gemcitabine through arterial perfusion, synergism anti-tumor activity was happened through inducing the apoptosis of tumor cell.

celecoxib；gemcitabine；arterial chemotherapy; lung cancer

何陽，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槟[瘤微創(chuàng)介入。

曹軍，E-mail：13611890000@163.com

上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(20124Y096);上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(12ZR1428900)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.32.003

R-332

A

1008-8849(2015)32-3542-04

2015-03-15