飼料中轉(zhuǎn)基因大豆成分檢測(cè)

劉彥泓 劉岑杰

摘?要：

轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的商品化滿足了人民日益增長(zhǎng)的物質(zhì)需求，但轉(zhuǎn)基因作物在食用安全性、對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響等方面一直備受關(guān)注。本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)飼料及飼料原料中轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分，可以準(zhǔn)確、快速完成檢測(cè)，滿足飼料中轉(zhuǎn)基因成分的監(jiān)管需求。實(shí)驗(yàn)表明目前飼料中轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分的占有率較高，應(yīng)引起相關(guān)部門的重視，加大監(jiān)管力度。

關(guān)鍵詞：

飼料;轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2;實(shí)時(shí)熒光PCR

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230008

19世紀(jì)80年代興起的DNA重組技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)表明：從1996年生物技術(shù)即轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化第1年以來(lái)到2018年底，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增長(zhǎng)了約113倍，目前已經(jīng)累計(jì)達(dá)到25億hm2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示2018年有26個(gè)國(guó)家種植了約1.917億hm2轉(zhuǎn)基因作物，全世界有70個(gè)國(guó)家或地區(qū)應(yīng)用了轉(zhuǎn)基因作物。我國(guó)是轉(zhuǎn)基因作物種植大國(guó)，2018年轉(zhuǎn)基因作物種植面積為290萬(wàn)hm2，居世界第8位[1]。我國(guó)除了是轉(zhuǎn)基因作物的種植大國(guó)，也是轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)口大國(guó)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品除了可能存在潛在的環(huán)境污染、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，也可能對(duì)人類健康和自然環(huán)境帶來(lái)不利影響[2]。對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性，特別是轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人和動(dòng)物的健康以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，就是世界各國(guó)及聯(lián)合國(guó)等國(guó)際組織關(guān)心的焦點(diǎn)問題。因此轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的使用安全性問題一直是人們關(guān)心的問題，2002年歐盟要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品從生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存、銷售等過(guò)程進(jìn)行全程的跟蹤和檢測(cè)[3]。目前已有幾十個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品采取強(qiáng)制性的標(biāo)志管理制度。我國(guó)2002年3月20日起施行的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》規(guī)定：轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的直接加工品，標(biāo)注為“轉(zhuǎn)基因××加工品（制成品）”或者“加工原料為轉(zhuǎn)基因××”。因此開展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)，建立完善的檢測(cè)方法，對(duì)滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管要求、保證轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理制度方面有重大意義。

目前國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)方法主要有2種：核酸水平的檢測(cè)和蛋白水平的檢測(cè)[4]。核酸檢測(cè)技術(shù)主要包括普通定性PCR檢測(cè)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)、數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)、基因芯片檢測(cè)技術(shù)以及二代測(cè)序檢測(cè)技術(shù)等;蛋白檢測(cè)技術(shù)主要包括SDS聚丙烯凝膠電泳分析檢測(cè)技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)技術(shù)等[5]。另外，還有紅外光譜技術(shù)鑒別檢測(cè)方法等其他方法[6]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，檢測(cè)飼料中轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分，針對(duì)pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2品系特異基因進(jìn)行檢測(cè)，選擇市場(chǎng)上市售的不同種類的飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，表明完全可以滿足日常檢測(cè)需求，為飼料產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因大豆成分檢測(cè)提供檢測(cè)技術(shù)支持。

1?材料

1.1?原料及試驗(yàn)樣品

所有原料和市售飼料樣品購(gòu)自農(nóng)村小型商店、寵物市場(chǎng)以及超市。原料為4種豆粕;市售飼料樣品4種，包括肉牛專用復(fù)合預(yù)混料、中豬預(yù)混料、產(chǎn)蛋雞飼料、通用型狗糧。轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2豆粉標(biāo)準(zhǔn)品為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2?主要試劑

樣本DNA提取采用試劑盒：Magnetic DNA Purification System For Food（Promega公司產(chǎn)品）;實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑：Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）（Takara Bio公司產(chǎn)品）。

1.3?引物及探針序列

引物及探針合成、標(biāo)記均為Takara Bio公司產(chǎn)品，引物及探針序列見表1。

1.4?主要儀器

低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：5427R ），Eppendorf（艾本德中國(guó)有限公司）產(chǎn)品;實(shí)時(shí)熒光PCR儀（型號(hào)：QuantStudio 7Flex），Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific（賽默飛世爾科技有限公司）產(chǎn)品。

2?方法

2.1?模板DNA的提取

將樣品分別研磨成粉后采用Promega公司Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒提取，提取的過(guò)程注意防止交叉污染。

2.2?實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

反應(yīng)體系見表2。

擴(kuò)增條件95℃ 10min;95℃ 1min，60℃ 30s（讀取熒光），40個(gè)循環(huán)。

2.3?實(shí)驗(yàn)設(shè)置

每個(gè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)均需要設(shè)置2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)還應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中使用轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2提取的DNA為模板;陰性對(duì)照：實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中采用已知不含轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的大豆DNA為模板;空白對(duì)照：實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中使用無(wú)菌雙蒸水代替DNA模板。

3?結(jié)果及分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，內(nèi)源基因Lectin和外源基因pCaMV35S 、tNOS 、GTS40-3-2檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均符合要求，判定該樣品含轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分。擴(kuò)增圖見圖1至圖4。（結(jié)果為單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同）。

樣品1～8分別為：1號(hào)豆粕、2號(hào)豆粕、3號(hào)豆粕、4號(hào)豆粕、肉牛專用復(fù)合預(yù)混料、中豬預(yù)混料、產(chǎn)蛋雞飼料、通用型狗糧）。檢驗(yàn)結(jié)果表明：僅8號(hào)樣品未檢出轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分，其余7個(gè)樣品均含有大豆GTS40-3-2成分。

4?結(jié)論與討論

目前對(duì)于轉(zhuǎn)基因大豆成分的檢測(cè)，最常采用的檢測(cè)方法就是PCR檢測(cè)方法，而實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)有很多：如靈敏度高、操作方便、檢測(cè)時(shí)間短等[4]。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR TaqMan探針技術(shù)在植物基因鑒定、水產(chǎn)漁業(yè)等方面已經(jīng)得到了很普遍的應(yīng)用[8]。對(duì)8份市售飼料原料及產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明：4份豆粕中均檢出轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分，4份飼料中僅通用型狗糧未檢出轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分，其它3種飼料均含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分。本研究表明實(shí)時(shí)熒光PCR方法完全可以滿足飼料中轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分檢測(cè)要求，可以用來(lái)快速、準(zhǔn)確地開展日常檢測(cè)工作。本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)飼料多經(jīng)過(guò)高溫蒸煮、烘烤等生產(chǎn)工藝，因此提取的DNA模板的DNA濃度和純度不高，模板的濃度和純度對(duì)目的基因的檢測(cè)來(lái)說(shuō)是較為重要的。建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定模板DNA的濃度，并計(jì)算出A260 nm/A280 nm的比值，通常情況下，比值在1.7～2.0之間比較好。同時(shí)，在模板DNA質(zhì)量滿意的情況下，建議實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中模板的添加量為50～100 ng。日常檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示飼料中使用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的比例很高，而我國(guó)對(duì)飼料及飼料原料中轉(zhuǎn)基因成分的使用管理力度不大，建議相關(guān)部門加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的使用進(jìn)行監(jiān)管，保證含有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的飼料合理、合法使用。

參考文獻(xiàn)

[1] 2018年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].中國(guó)生物工程雜志，2019，39（08）：1-6.

[2]王南，李海燕.轉(zhuǎn)基因大豆概況及其安全性[J].吉林農(nóng)業(yè)，2016（19）：118.

[3]方獻(xiàn)平，馬華升，余紅，金亮，劉輝，張樂，翁麗萍，來(lái)文國(guó).轉(zhuǎn)基因常見檢測(cè)技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（10）：1328-1330.

[4]孟靜，任易婕，孫瀟慧，鐘麗霞，霍勝楠.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)豆制品中轉(zhuǎn)基因成分的研究概述[J].中國(guó)釀造，2018，37（11）：22-25.

[5]石盼盼，王璐，郝麗花，謝文佳，等.大豆及其加工食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（10）：3166-3172.

[6]方慧，張昭，王海龍，楊向東，何勇，鮑一丹.基于中紅外光譜技術(shù)鑒別轉(zhuǎn)基因大豆的方法研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2017，37（03）：760-765.

[7]國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局、中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T19495.4-2018 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法[S].中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[8]姜文燦，岳素文，江洪，等.TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用和研究進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志（電子版），2015，4（01）：797-805.

作者簡(jiǎn)介：

劉彥泓（1976-），女，碩士，高級(jí)工程師。研究方向：分子生物學(xué)及微生物學(xué)檢驗(yàn)。