顯微鏡計數(shù)法測定浮游植物的研究進展及修訂建議

鐵 程，張榆霞，金 玉，趙琦琳，施 擇，李愛軍，李 穎

云南省環(huán)境監(jiān)測中心站,云南 昆明 650034

浮游植物一般指浮游藻類，是懸浮于水中生活的微小藻類植物[1]。浮游植物的種類組成特點和數(shù)量的變化，能敏感地反映復雜的環(huán)境因子變動[2-3]。武漢東湖30年來浮游植物的演變規(guī)律以及國內(nèi)許多同類調(diào)查研究都證明：湖泊(水庫)浮游植物數(shù)量的增加，特別是藍藻豐長和生長季節(jié)的延長是湖泊富營養(yǎng)化的一個重要標志[4]。因此，浮游植物群落結(jié)構(gòu)特征和時空變化是水環(huán)境監(jiān)測、水質(zhì)評價、水環(huán)境污染研究、水體生態(tài)修復和治理的重要內(nèi)容[4-8]。

顯微鏡計數(shù)法是淡水浮游植物測定最常用的經(jīng)典方法，不僅可以測定浮游植物生物量，還可以進行浮游植物的種類及群落結(jié)構(gòu)分析[9]。國內(nèi)開展顯微鏡計數(shù)法測定浮游植物密度的主要依據(jù)有《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]以及《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]等規(guī)范和文獻。美國、英國和歐盟等國家和地區(qū)也制定了相關標準和規(guī)范。如英國的WaterQuality-GuidanceStandardontheEnumerationofPhytoplanktonUsingInvertedMicroscopy(BS/EN 15204∶2006)[12]對浮游藻類樣品的保存、準備、計數(shù)、質(zhì)量保證、不確定度的評估等方面進行了全面細致的規(guī)定。美國的StandardClassificationforSamplingPhytoplanktoninSurfaceWaters(D4149-1982)[13]規(guī)定了采集浮游藻類的常用技術(shù)和工具；StandardTestMethodforAnalysisofPhytoplanktoninSurfaceWaterbytheSedgwick-RafterMethod(D4148-1982)[14]對樣品的保存、前處理、藻細胞密度的測定過程、精密度和偏差的計算方法進行了規(guī)定。StandardPracticeforPreservingPhytoplanktonSamples(D4137-1982)[15]對浮游植物樣品保存試劑、條件和期限進行了規(guī)定。英國的WaterQuality-EnumerationofMicro-OrganismsinWaterSamples-GuidanceofVariationofResultwithParticularReferencetotheContributionofUncertaintyofMeasurement(BS 8496∶2007)[16]給出了在水生微生物定量分析中，測量不確定度對測定結(jié)果誤差貢獻的評估方法，并分析了實際案例。

國外相關標準中有一些方法和技術(shù)值得中國研究者學習借鑒，經(jīng)驗證、轉(zhuǎn)化后能夠用于完善中國相關規(guī)范，更好地指導中國淡水浮游植物的測定。

1 國外相關分析標準

美國、英國和歐盟等國家和地區(qū)的標準在結(jié)構(gòu)上有較大的區(qū)別。美國材料與試驗協(xié)會(ASTM)按采集、保存、分析將測定過程分為3個主要部分，用8個標準分別進行了規(guī)定。英國的BS/EN 15204∶2006標準[12]涵蓋了測定的全過程，并用BS 8496∶2007標準[16]規(guī)定了測量不確定度對測定結(jié)果誤差貢獻的評估方法。為便于介紹，按測定過程的主要環(huán)節(jié)(采樣工具、樣品保存、樣品前處理、樣品濃縮、計數(shù)對象、浮游植物在計數(shù)框中的分布、計數(shù)方式、適宜測定的密度、計數(shù)量與精密度、檢出限)對美國、英國和歐盟等國家和地區(qū)相關標準(表1)進行介紹。

表1 國外浮游植物測定標準Table 1 List of foreign methods about the enumeration of phytoplankton

1.1 采樣工具

美國的D4149-1982標準[13]規(guī)定了采集浮游藻類的常用技術(shù)。定性樣品的采集常用浮游生物網(wǎng)和泵。定量樣品的采集常用Clarke-Bumpus浮游植物采樣器、Juday浮游植物阱和采水瓶。使用者結(jié)合研究需要、采樣區(qū)情況和浮游藻類的天然特性選擇適合的工具和技術(shù)。針對每種采樣工具，分別制定了5個規(guī)程[17-21]。

泵、Clarke-Bumpus浮游植物采樣器和Juday浮游植物阱在國內(nèi)較不常用，是一種用泵吸取所需深度的水樣，用網(wǎng)來富集浮游藻類的半定量采樣裝置，通過流量計測定進入采樣器水樣的體積實現(xiàn)半定量。采水瓶與國內(nèi)常用的有機玻璃采水器類似。

1.2 樣品的保存

英國的BS/EN 15204∶2006標準[12]規(guī)定定性樣品不加保護劑，4～10 ℃暗處保存，36 h內(nèi)完成分析；定量樣本加入魯哥氏液，使其在樣品中的濃度達到5%，常溫暗處保存3個星期，1～5 ℃保存1年。若保存時間要超過1年，則需要加入37%的福爾馬林溶液，使其在樣品中的濃度達到4%。美國的D4137-1982標準[15]規(guī)定了相同的保護劑，但對定性樣品的保存環(huán)境和保存時間要求更嚴格。

1.3 樣品的前處理

BS/EN 15204∶2006[12]非常重視樣品的混勻，將混勻視為對檢測結(jié)果有重大影響的步驟。該標準指出：為了統(tǒng)一不同測定人員的混勻操作，應該對混勻的方式、時間和力度等進行詳細描述和規(guī)定。多次水平搖動并結(jié)合上下顛倒樣品瓶的方式對樣品的混勻效果好于單一方向的搖動。搖動的力量不易過大，否則可能導致氣泡產(chǎn)生和群體的解離。該標準還提及：為了便于細胞計數(shù)，可以用超聲波震蕩儀對群體形式的浮游植物進行處理，以促進群體細胞的解離，但同時要注意避免過度處理造成浮游植物細胞破損。

1.4 樣品的濃縮

D4148-1982標準[14]指出：依據(jù)鏡檢結(jié)果和分析人員的經(jīng)驗決定是否需要對樣品進行濃縮或稀釋處理。濃縮方式為量筒沉淀法。根據(jù)量筒中水樣的高度，按照4 h/cm計算沉淀時間。該標準還提及了一種稱重方法：稱取1 g左右的水樣于容器中，并記錄準確的稱重結(jié)果，待水樣中的浮游藻類充分沉淀后，移去大部分上層水樣，再進行稱重。用2次稱重結(jié)果計算濃縮倍數(shù)。

BS/EN 15204∶2006標準[12]指出：濃縮水樣中的浮游藻類比較耗時，且會引入誤差，因此，應當盡量避免濃縮處理?？梢圆捎贸恋怼㈦x心或過濾的方式進行濃縮。沉淀是最常用的濃縮方式。加入到沉淀器中水樣的高度不能超過沉淀器直徑的5倍。

1.5 計數(shù)對象

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標準[22]未明確規(guī)定計數(shù)對象為細胞還是群體，而是指出以細胞為對象，計數(shù)結(jié)果較為準確，但比較費時；以群體為計數(shù)對象則較為方便，但計數(shù)結(jié)果較不準確。使用者可根據(jù)自己的需求和實際情況進行選擇，并在結(jié)果報告中說明。

BS/EN 15204∶2006標準[12]將情況分為3種：①當群體中的浮游植物細胞個體較易被辨識時，可將細胞作為計數(shù)對象；②當同種浮游植物群體中所含細胞數(shù)量穩(wěn)定時，可將群體作為計數(shù)對象，用群體數(shù)乘以群體中平均細胞數(shù)；③當不具備上述2個條件時，采用超聲波震蕩或水解方式離散群體中的細胞，然后以細胞為對象計數(shù)。

1.6 浮游植物在計數(shù)框中的分布

BS/EN 15204∶2006標準[12]認為浮游植物隨機分布于計數(shù)框中是按標準開展測定、估計測定誤差的前提，并提出了一些保障措施：在計數(shù)之前，應在低倍數(shù)下，對整個計數(shù)框進行觀察，以確認浮游藻類是否為隨機分布；低溫保存過的樣品，需要將其放置至室溫后，再加入計數(shù)框中；如果樣品的溫度低于計數(shù)框，通常較大、較重的浮游植物會傾向分布于計數(shù)框的周邊，較小的浮游植物傾向分布于計數(shù)框的中央。

1.7 計數(shù)方式

BS/EN 15204∶2006標準[12]中提出了3種計數(shù)方式：隨機視野法、行條法和全片法，并指出隨機視野法能夠在工作量相對不大的情況下，給出相對最準確的結(jié)果。因為行條法只觀察了計數(shù)框的中間部分，如果浮游植物在計數(shù)框中的分布不均勻會影響結(jié)果的準確性，而隨機視野法能夠克服這個問題。

D4148-1982標準[14]中提出了2種計數(shù)方式和適用范圍：行條法適用于藻細胞密度較低的水樣、視野法適用于藻細胞密度較高的水樣。

1.8 最佳檢測范圍

BS/EN 15204∶2006標準[12]對適宜測定的浮游植物密度提出了定性要求：測試的水樣應滿足藻細胞之間、藻細胞與顆粒雜質(zhì)之間不相互粘合或堆疊；過低的藻密度將導致大的隨機誤差；過高的藻密度將會導致觀察困難、耗時和測定人員的疲勞。

1.9 計數(shù)量與精密度

BS/EN 15204∶2006標準[12]提出：浮游藻類的計數(shù)量由測定所需的精度決定。在日常分析工作中，應事先設定精度，精度可以由標準偏差、相對標準偏差、95%相對置信區(qū)間等表示，并且給出了相對標準偏差與計數(shù)量的關系式：

(1)

如將精密度(以相對標準偏差表示)設定為5%，則應該至少計數(shù)400個浮游藻類。

如果精密度由置信區(qū)間表示，則用公式(2)計算：

(2)

如當浮游藻類計數(shù)量為400個時，95%置信區(qū)間為測定結(jié)果±10%。

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標準[22]中給出了與公式(2)類似的計算方法。2個國外標準均指出：浮游植物隨機分布于計數(shù)框中，是準確估計最少計數(shù)量或精密度的前提和保障。

1.10檢出限

BS/EN 15204∶2006標準[12]認為檢出限是浮游植物測定方法的重要性能指標。對于隨機分布于計數(shù)框中的單種藻類，檢出限可由泊松統(tǒng)計模型得到。

(3)

式中:α為顯著水平；ndet為檢出限；ftotal為計數(shù)框的總視野數(shù)；fcounted為被計數(shù)的視野數(shù)。

2 國內(nèi)相關規(guī)范

《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]、《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]等是國內(nèi)顯微鏡計數(shù)法測定浮游植物密度的重要標準和規(guī)范性文獻。在樣品的采集、保存和濃縮方面，它們均采用了25號浮游生物網(wǎng)采集定性樣品；用有機玻璃采水器采集定量樣品；用魯哥試劑或福爾馬林試劑保存定量樣品；用沉淀法和虹吸法濃縮水樣中的浮游植物。樣品的測定方面，它們均采用了中國通用的面積為20 mm×20 mm、容量為0.1 mL的浮游植物計數(shù)框，框內(nèi)劃分橫豎各10行、10列，共100個小方格。計數(shù)方式主要有全片法、行格法、視野法和對角線法。觀察和計數(shù)全部100個小格的全片法較耗時耗力，一般較多采用觀察計數(shù)框中的一部分區(qū)域的方法(如觀察藻類計數(shù)框中第2、5、8行，共30個小方格的行格法，觀察一定數(shù)量的顯微鏡可見區(qū)域的視野法，只觀察位于計數(shù)框?qū)蔷€位置上的10個小方格的對角線法等)。質(zhì)量控制方面，它們均規(guī)定“不大于±15%”，但對誤差的描述有所不同，分別為“兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差”“每次計數(shù)的結(jié)果與其平均值之差”和“相對偏差”。

3 國內(nèi)規(guī)范中的不足

3.1 國內(nèi)規(guī)范未對浮游植物在計數(shù)框中的分布提出要求

BS/EN 15204∶2006標準[12]很重視浮游植物在計數(shù)框中的分布，認為浮游植物隨機分布是準確測定和估計測量不確定度的前提。

對于僅觀察計數(shù)框中部分區(qū)域的計數(shù)方式，浮游植物在計數(shù)框中的分布對測定的精密度有較大影響。筆者分析了3家實驗室用對角線法重復測定洱海、撫仙湖和滇池水樣的結(jié)果(表2)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，浮游植物在計數(shù)框中越符合泊松分布，重復測定結(jié)果的一致性越好。

《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]和《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]等標準和規(guī)范性文獻沒有對浮游植物在計數(shù)框中的分布提出要求，也沒有給出促使浮游植物隨機分布于計數(shù)框中的有關措施。

3.2 國內(nèi)規(guī)范未對設定最少計數(shù)量進行說明

BS/EN 15204∶2006標準[12]提出由測定所需的精密度決定浮游植物的計數(shù)量，并給出了兩者的定量關系式。在開始測定前應先設定測定需達到的精度要求，然后根據(jù)定量關系式算出測定中所需的最少計數(shù)量。StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標準[22]中提出可根據(jù)浮游植物的計數(shù)量估計測定結(jié)果的置信區(qū)間，相反也能夠根據(jù)測定誤差的要求，計算所需的最少計數(shù)量。

筆者分別應用對角線法、行格法和全片法對稀釋10倍、原水和濃縮10倍的洱海水樣進行了重復(7次)測定。通過統(tǒng)計平均計數(shù)量、平均觀察到的浮游植物種類數(shù)和重復測定結(jié)果的相對標準偏差(表3)發(fā)現(xiàn)：①隨計數(shù)量的增加，觀察到的浮游植物種類越多(圖1);②隨計數(shù)量的增加，重復測定結(jié)果越一致(圖2);③根據(jù)擬合方程的測算，當浮游植物最少計數(shù)量不少于1 200個時，相對標準偏差能達到小于15%的要求。牛海玉等采集了3座不同營養(yǎng)水平的水庫及3組不同處理的實驗圍隔樣品，對每個樣品進行了重復測定，同樣發(fā)現(xiàn)隨計數(shù)量的增加，浮游植物豐度偏差減小，并且隨計數(shù)量增加鏡檢到的浮游植物種類數(shù)增加[23]。

表2 3家實驗室重復測定結(jié)果及統(tǒng)計分析結(jié)果Table 2 Repeated measurement results and statistical analysis results in three laboratories

表3 重復測定結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Statistical results of repeated determination

圖1 浮游植物細胞計數(shù)量與觀察到的浮游植物種類的關系Fig.1 Relationship between phytoplankton counts and observed phytoplankton species

圖2 浮游植物細胞計數(shù)量與重復測定結(jié)果一致性的關系Fig.2 Relationship between phytoplankton counts and the consistency of repeated measurements

《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]和《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]中未明確最少計數(shù)量的要求。《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)規(guī)定了計數(shù)量宜為500～1 500個，但表述過于簡單，未明確將計數(shù)量與精密度聯(lián)系起來，不便于測定人員根據(jù)測定要求設定合理的計數(shù)量。

3.3 國內(nèi)規(guī)范未給出檢出限的確定方法

《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]和《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]中沒有給出顯微鏡計數(shù)法的檢出限，也沒有給出確定檢出限的方法。雖然《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術(shù)導則》(HJ 168—2010)中給出了確定檢出限的方法，但顯微鏡計數(shù)法與化學分析方法有較大區(qū)別，難以直接應用該導則中的方法確定其檢出限。

BS/EN 15204∶2006標準[12]提出了關于浮游植物的測定——顯微鏡計數(shù)法的檢出限定義:對于單種藻類，在單次計數(shù)過程中，發(fā)現(xiàn)它的概率不低于某個規(guī)定要求時，該藻類在水樣中的密度即為檢出限，并應用泊松分布模型計算滿足檢出限定義的藻密度。

借鑒BS/EN 15204∶2006標準[12]的定義和計算方法，將顯微鏡計數(shù)法的檢出限定義為對于單種藻類，在單次計數(shù)過程中，發(fā)現(xiàn)它的概率不低于99%時，最低的藻密度即為檢出限。以泊松分布模型為基礎，對國內(nèi)規(guī)范中的對角線計數(shù)、行格計數(shù)、全片計數(shù)和隨機視野計數(shù)的檢出限進行計算。泊松分布模型計算公式為

(4)

式中：P(x)為連續(xù)觀察n個計數(shù)格，每個計數(shù)格出現(xiàn)x個藻細胞的概率；λ為單個計數(shù)格中浮游植物細胞平均數(shù)量，個；x為預計單個計數(shù)格中浮游植物細胞的數(shù)量，個；n為觀察的計數(shù)格數(shù)，個。

為結(jié)合實際測定過程，將上述檢出限的定義適當轉(zhuǎn)化為對于單種浮游植物，連續(xù)觀察計數(shù)框中的n個計數(shù)格后，未發(fā)現(xiàn)它的概率為1%時，所對應的水樣中該種類浮游植物的細胞密度。根據(jù)定義可知：P(x)=1%、x=0，求λ。帶入式(4)得到式(5)：

(5)

式中：λ為單個計數(shù)格中浮游植物細胞平均數(shù)量，個；n為觀察的計數(shù)格數(shù)，個。

再將λ的計算結(jié)果帶入式(6)，即可得出檢出限。

DL=Nλ/v

(6)

式中：DL為檢出限，個/L；N為計數(shù)框中計數(shù)格的總數(shù)，個；v為加入計數(shù)框中的水樣的體積，L。

對角線計數(shù)、行格計數(shù)檢出限的計算：已知N=100個，v=0.000 1 L，對角線計數(shù)、行格計數(shù)觀察的計數(shù)格分別為n=10、n=30個，將已知參數(shù)代入式(4)、式(5)可算得對角線計數(shù)、行格計數(shù)的檢出限分別為DL=4.6×105個/L，DL=1.5×105個/L。

全片計數(shù)檢出限的計算：當對整個計數(shù)框中全部100個計數(shù)格逐一觀察計數(shù)時，如果觀察過程十分細致，計數(shù)框中僅有1個浮游植物細胞也能夠被檢出。因此，全片計數(shù)法決定檢出限的環(huán)節(jié)是從樣品中吸取0.1 mL水樣裝入計數(shù)框時，吸取到0個藻細胞的概率為1%時，樣品中藻細胞的密度。因此需將式(4)、式(5)中各參數(shù)的意義調(diào)整為P(x)為0.1 mL水樣中含有x個藻細胞時的概率；λ為0.1 mL中含有藻細胞的平均數(shù)量，個；x為預計0.1 mL水樣中含有藻細胞的數(shù)量，個；n為從水樣中取樣的次數(shù)。

將式(6)改為式(7)：

DL=λ/v

(7)

式中：DL為檢出限，個/L；v為吸取水樣的體積，L。

已知：P(x)=1%，x=0個，n=1次，v=0.000 1 L，代入式(5)、式(6)后求得λ=4.6個、全片計數(shù)法的DL=4.6×104個/L。

隨機視野檢出限的計算：由于檢出限與觀察的視野數(shù)、視野面積和計數(shù)框面積有關，根據(jù)式(8)、式(9)計算：

(8)

(9)

式中：λ為單個視野中浮游植物細胞平均數(shù)量，個;n為隨機視野數(shù)，個；DL為檢出限，個/L；S為計數(shù)框的面積，cm2；s為一個視野的面積，μm2；v表示加入計數(shù)框中的水樣的體積，L。

如已知計數(shù)框的面積為S=4 cm2。顯微鏡放大倍數(shù)為400倍時，經(jīng)校準得知1個視野的面積為s=90 716.8 μm2。在觀察了n=300個視野的條件下，經(jīng)計算隨機視野的DL=6.8×105個/L。

表4 4種計數(shù)方式的檢出限Table 4 Detection limits of 4 kinds of counting pattern

注：隨機視野方式的檢出限與觀察的視野數(shù)、視野面積和計數(shù)框面積有關，應根據(jù)具體測定條件進行計算。

4 完善國內(nèi)規(guī)范的建議

4.1 對浮游植物在計數(shù)框中的分布提出要求

浮游植物隨機分布于計數(shù)框中是提高測定精密度，準確估計測定誤差和確定檢出限的保障。因此，在相關規(guī)范中應提出“在開始顯微鏡計數(shù)前，應先確認浮游植物隨機分布于計數(shù)框中”的要求，并提出一些保障措施(如應在開始計數(shù)前在顯微鏡的低放大倍數(shù)下，對浮游植物在計數(shù)框中的分布進行確認，當滿足隨機分布時才開始計數(shù)；經(jīng)低溫保存的樣品，在向計數(shù)框中加注水樣前，應將樣品在室溫下放置足夠長的時間，使水樣與計數(shù)框的溫度相同)。

4.2 對浮游植物的最少計數(shù)量提出要求

一般來說，測定中對浮游植物的計數(shù)量越多，重復測定結(jié)果間的一致性越好，同時觀察到的浮游植物種類數(shù)也越多。但一味增加計數(shù)量會造成測定時間的延長，會導致計數(shù)框中樣品的過量蒸發(fā)和空氣的進入，反而嚴重影響測定的準確性。因此在相關規(guī)范中應結(jié)合測定精度的要求，提出恰當?shù)挠嫈?shù)量，使測定方案一方面滿足精度要求，盡量減少遺漏的浮游植物種類，另一方面使工作量在可接受范圍內(nèi)。

BS/EN 15204∶2006標準[12]中提出的：由測定所需的精度決定浮游植物的計數(shù)量(并給出了兩者的定量關系式)，為如何確定最少計數(shù)量提供了參考依據(jù)，值得國內(nèi)相關研究人員參考和借鑒。

4.3 給出檢出限的確定方法

檢出限是分析方法重要的性能指標之一，在《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術(shù)導則》(HJ 168—2010)中規(guī)定，檢出限是環(huán)境監(jiān)測分析方法的必備要素，在相關規(guī)范中應給出顯微鏡計數(shù)法的檢出限或檢出限的確定方法，但該導則中給出的確定檢出限的方法不適用于顯微鏡計數(shù)法。

BS/EN 15204∶2006標準[12]將顯微鏡計數(shù)法的檢出限定義為在測定過程中發(fā)現(xiàn)某種浮游植物的概率不低于某個要求時，該種浮游植物在水樣中的密度，并應用統(tǒng)計學方法計算出符合定義要求的浮游植物的密度。這種確定顯微鏡計數(shù)法檢出限的方法值得國內(nèi)相關研究人員參考和借鑒。