Podocalyxin基因沉默對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響

胡雪晴 林芙君 吳偉斌 王 瑞 許 娜 王福奔張兆永 王增慧 張 琦 李向陽 華 卉 湯仁仙 任紅旗，

足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿的重要原因[1]。足細(xì)胞內(nèi)系列蛋白分子(如nephrin，podocin，CD2AP,PODXL等)表達(dá)變化和(或)分子結(jié)構(gòu)改變均可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能異常[1-2]。PODXL和Nephrin是高度唾液酸化的分子，其唾液酸化被認(rèn)為是形成和維持足細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵[3]。其中，PODXL是頂端細(xì)胞表面的主要組成成分，通過電荷排斥作用維持足突間復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，尿液中可檢出PODXL，并用作腎小球疾病的標(biāo)志物，如IgA腎病和膜性腎病[5]，此外，PODXL是局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)的致病基因，PODXL完全缺乏將導(dǎo)致先天性腎病綜合征[6]。ezrin是ezrin-radixin-moesin(ERM)蛋白質(zhì)家族的成員，PODXL通過NHERF(鈉 /氫交換調(diào)節(jié)因子)結(jié)合于ezrin，并通過小GTP酶Rho的活化來維持足突結(jié)構(gòu)[7]。 RhoA是細(xì)胞骨架絲束聚合的正調(diào)節(jié)劑，可磷酸化并激活ezrin，活化的ezrin(即p-ezrin)把PODXL及各種其他質(zhì)膜蛋白連接到細(xì)胞骨架[8]。本文旨在探討PODXL是否通過影響足細(xì)胞骨架排列、促進(jìn)足細(xì)胞凋亡參與足細(xì)胞損傷過程，以及探討PODXL基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化的機(jī)制。

材料與方法

足細(xì)胞培養(yǎng)與分組MPC-5條件永生化小鼠足細(xì)胞系由劉志紅院士惠贈(zèng)。小鼠足細(xì)胞在含10%胎牛血清(Excell Biology，上海)、100 U/ml青霉素及100 mg/L鏈霉素(Gibco，美國)、10 U/ml干擾素-γ(IFN-γ)(Sigma，美國)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，33 ℃、5%CO2條件下增殖傳代。在37 ℃、5%CO2條件下用無IFN-γ的培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14d獲得分化表型。本實(shí)驗(yàn)所有足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在分化成熟后進(jìn)行。細(xì)胞分為空白組(Vehicle)、模擬組(Mock)、陰性對(duì)照組(Sh-nc)、SiRNA組(Si)、ezrin抑制組(NSC305787)；轉(zhuǎn)染時(shí)空白組僅加入不完全培養(yǎng)基，模擬組加入轉(zhuǎn)染試劑，陰性對(duì)照組加入轉(zhuǎn)染試劑及無義序列，Si組加入轉(zhuǎn)染試劑及siRNA序列(靶序列CCACTACACACAAACCATT)(銳博生物，廣州)，6h后更換成完全培養(yǎng)基；而ezrin抑制組則加入ezrin抑制劑(10 μmol/L，MCE，美國)。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照美國Invitrogen公司LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染說明書操作。在足細(xì)胞匯合度達(dá)30%～50%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將分別配制轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine的無血清培養(yǎng)基和siRNA的無血清稀釋液混合，室溫靜置20 min后加入含有不完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃混勻。培養(yǎng)6h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48～72h后，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

足細(xì)胞骨架染色處理過的足細(xì)胞爬片，37 ℃ 預(yù)熱的PBS洗滌3遍后用4%多聚甲醛固定10 min后洗滌；0.5% Triton X-100通透5 min，洗滌5 min×3次；室溫避光條件下鬼筆環(huán)肽(10 μg/mL，sigma，美國)孵育40 min，洗滌，甘油封片，共聚焦熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)掃描采集圖像。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后用200 μl的槍頭對(duì)12孔板中的細(xì)胞進(jìn)行劃痕，并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后0h、24h在觀察并記錄細(xì)胞遷移情況。用 Image-Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞未覆蓋的面積。每組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)3個(gè)樣本，重復(fù)3次。

劃痕愈合率=1-(各時(shí)間點(diǎn)劃痕面積/開始的劃痕面積×100%)

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力收集轉(zhuǎn)染后48h的各組細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1×105/ml，采用含孔徑8.0 μm聚碳酸酯膜的transwell小室(24孔)，在上室中加入200 μl足細(xì)胞懸液，下室中加入600 μl 完全培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后取出小室，棉簽擦去小室膜上部的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min后，結(jié)晶紫染色。400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值，作為穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照美國BD公司Annexin V PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作。預(yù)冷PBS洗滌2遍后收集各組細(xì)胞，用 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞至1×106/ml，各組取100 μl細(xì)胞懸液加入PE Annexin、7AAD避光常溫孵育15 min，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

蛋白免疫印跡取細(xì)胞蛋白測(cè)蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液煮沸；每孔上樣80 μg經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉，TBST洗膜，一抗(PODXL 1∶ 1 000，Novus)，(p-ezrin 1∶ 800，Sigma)，(ezrin 1∶ 1 500，Abcam)，(β-actin1∶ 1 000，碧云天)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，二抗(1∶ 5 000 Santa Cruz)室溫孵育2h，TBST洗膜，滴加超敏ECL發(fā)光液顯影，Image J 軟件分析各組蛋白表達(dá)。

足細(xì)胞RhoA活性測(cè)定按照美國Cytoskeleton公司G-LISA試劑盒說明方法操作，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各組吸光度值，讀數(shù)三次，計(jì)算平均值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 提取RNA后測(cè)定RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄RNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書操作檢測(cè)目的基因表達(dá)。引物序列如下表1。

表1 PODXL、Ezrin、β-actin引物序列

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較，若方差齊用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化Vehicle組足細(xì)胞骨架肌纖維排列有序、肌絲強(qiáng)勁有力、密度大，熒光顯示清晰；Si組、ezrin抑制組足細(xì)胞微絲解聚、胞體回縮，骨架排列紊亂，熒光明顯模糊減弱；Mock及Sh-nc組與Vehicle組無明顯差異。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力PODXL沉默組、ezrin抑制組足細(xì)胞的劃痕愈合速度顯著慢于其他三組(P<0.05)(圖1)，表明沉默PODXL或抑制ezrin磷酸化可抑制足細(xì)胞的遷移能力。

圖1 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果(倒置相差顯微鏡,×100)Vehicle:空白組、Mock:模擬組、Sh-nc:陰性對(duì)照組、Si:SiRNA組、NSC305787：ezrin抑制組；a：與Si組比較，P<0.05；b：與NSC305787組比較，P<0.05

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力PODXL沉默組、ezrin抑制組的足細(xì)胞透過 Transwell 小孔的細(xì)胞數(shù)量明顯少于空白組，Mock及Sh-nc組與空白組無差異，表明PODXL表達(dá)量或p-ezrin表達(dá)量與足細(xì)胞的遷移能力呈正相關(guān)關(guān)系。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)Annexin V PE/7AAD雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示與其他三組相比，Si組、ezrin抑制組凋亡率增加(P<0.05)(圖2)，提示沉默PODXL、抑制ezrin磷酸化會(huì)誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)各組足細(xì)胞凋亡水平Vehicle:空白組、Mock:模擬組、Sh-nc:陰性對(duì)照組、Si:SiRNA組、NSC305787：ezrin抑制組；a：與Si組比較，P<0.05；b：與NSC305787組比較，P<0.05

PODXL、p-ezrin、ezrin蛋白表達(dá)Western Blot結(jié)果顯示，與Vehicle組相比，Si組PODXL蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且PODXL敲低后p-ezrin蛋白表達(dá)下調(diào)，Mock及Sh-nc組與Vehicle組無明顯差異；但各組間總ezrin表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)；ezrin抑制組p-ezrin蛋白表達(dá)較vehicle組下調(diào)(P<0.05)。

圖3 足細(xì)胞PODXL、p-ezrin、ezrin的蛋白表達(dá)Vehicle:空白組、Mock:模擬組、Sh-nc:陰性對(duì)照組、Si:SiRNA組、NSC305787：ezrin抑制組；A-C：敲低PODXL后p-ezrin、ezrin蛋白表達(dá)的改變；D、E：ezrin抑制劑對(duì)p-ezrin、ezrin蛋白表達(dá)的影響；a：與Si組比較，P<0.05；b：與NSC305787組比較，P<0.05

RhoA活性檢測(cè)與Vehicle組比較，Si組、ezrin抑制組足細(xì)胞RhoA活性明顯降低；Mock及Sh-nc組與Vehicle組無明顯差異(圖4)。

圖4 各組小鼠足細(xì)胞RhoA活性Vehicle:空白組、Mock:模擬組、Sh-nc:陰性對(duì)照組、Si:SiRNA組、:NSC305787：ezrin抑制組；OD值：吸光光度值；a：與Si組比較，P<0.05；b：與NSC305787組比較，P<0.05

PODXL和ezrin的mRNA表達(dá)與其他組比較，Si組PODXL mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，PODXL敲低或抑制ezrin磷酸化后各組ezrin mRNA表達(dá)無明顯差異(圖5)。

圖5 各組足細(xì)胞PODXL、ezrin的mRNA表達(dá)Vehicle:空白組、Mock:模擬組、Sh-nc:陰性對(duì)照組、Si:SiRNA組、NSC305787：ezrin抑制組；a：與Si組比較，P<0.05；b:與NSC305787組比較，P<0.05

討 論

足細(xì)胞是排列在腎小球毛細(xì)血管外的終末分化細(xì)胞，作為腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，幾乎所有的腎小球疾病的蛋白尿均與足細(xì)胞損傷有關(guān)[1-2]。足細(xì)胞上膜蛋白牢固地錨定于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，從而為細(xì)胞膜提供結(jié)構(gòu)支持，確定細(xì)胞形狀，并創(chuàng)建獨(dú)特的膜結(jié)構(gòu)域和微區(qū)。PODXL是足細(xì)胞中錨定于肌動(dòng)蛋白的關(guān)鍵頂膜蛋白，對(duì)維持足突特征和裂孔隔膜是結(jié)構(gòu)必不可少的。其具有多種功能，包括控制細(xì)胞粘附和遷移等[9-10]。在與足細(xì)胞相關(guān)的腎小球疾病中，通常廣泛存在足細(xì)胞的細(xì)胞骨架重排和PODXL低表達(dá)[11-13]，但具體機(jī)制尚不清晰。

本研究探討了PODXL對(duì)足細(xì)胞骨架肌絲排列和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，敲低足細(xì)胞PODXL基因表達(dá)后，足細(xì)胞骨架排列紊亂，遷移能力下降，細(xì)胞凋亡增加。我們研究進(jìn)一步證明PODXL在維持足細(xì)胞骨架穩(wěn)定性過程中起著重要作用。PODXL敲低后導(dǎo)致足細(xì)胞活動(dòng)力降低的直接原因是該分子參與了細(xì)胞骨架肌絲排列，當(dāng)PODXL基因表達(dá)下調(diào)后，導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力下降，細(xì)胞凋亡增加。

PODXL敲低后足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂、遷移能力下降的機(jī)制目前尚不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道PODXL通過NHERF和ezrin與肌動(dòng)蛋白連接，形成維持正常足突結(jié)構(gòu)的PODXL/NHERF/ezrin/actin復(fù)合物，并且這些復(fù)合物在腎病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭薪Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變[14-16]，因而我們推測(cè)PODXL敲低后可能通過改變PODXL/NHERF/ezrin/actin復(fù)合物結(jié)構(gòu)影響ezrin磷酸化，從而引起足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂、遷移能力下降、細(xì)胞凋亡增加。

ezrin是ERM蛋白家族的成員，主要表達(dá)于上皮組織(包括腎臟和胃腸組織)，并在其中起著不同的生理功能[13,17-18]。ezrin不僅作為跨膜蛋白的支架，而且可以作為小GTP酶Rho的調(diào)節(jié)劑。ezrin能夠與Rho GDP解離抑制劑(Rho-GDI)相互作用，并通過促進(jìn)Rho-GDI 與GDP結(jié)合的Rho-GTP酶的解離來間接活化Rho-GTP酶。Rho-GTP酶包括RhoA，Cdc42和Rac1，在細(xì)胞骨架重組調(diào)控中起重要作用[19-20]。Fukasawa等[21]研究表明PODXL在Ser415處的磷酸化防止了PODXL與ezrin的直接結(jié)合，影響RhoA活性，并且干擾PODXL錨定到細(xì)胞骨架。Wasik等[22]通過敲低足細(xì)胞上的ezrin，發(fā)現(xiàn)p-ezrin表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞肌絲斷裂、細(xì)胞骨架重排。我們研究發(fā)現(xiàn)在敲低足細(xì)胞PODXL基因后， p-ezrin表達(dá)下調(diào)，RhoA活性降低，而總ezrin表達(dá)無明顯改變；通過ezrin抑制劑抑制p-ezrin表達(dá)后，RhoA活性降低、細(xì)胞骨架微絲解聚、遷移減慢、凋亡增加；提示PODXL可能通過p-ezrin、RhoA通路引起足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂；導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力下降，細(xì)胞凋亡增加。

F-actin的解聚是凋亡過程中所必需的，其解聚出現(xiàn)在凋亡小體形成之前。既往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞骨架重排導(dǎo)致凋亡細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，微絲及中間絲迅速解聚，微管結(jié)構(gòu)重組，形成凋亡微管網(wǎng)，維持凋亡細(xì)胞形態(tài)，并與凋亡微絲共同包裹細(xì)胞器形成凋亡小體[23]。我們通過敲低PODXL發(fā)現(xiàn)p-ezrin、RhoA表達(dá)下調(diào)，引起足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂；因而我們推測(cè)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。

本研究尚存在一些不足，盡管我們?cè)隗w外證實(shí)了PODXL基因敲低對(duì)足細(xì)胞骨架排列和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生了影響，并且發(fā)現(xiàn)PODXL引起的足細(xì)胞骨架肌絲排列紊亂可能通過p-ezrin信號(hào)通路；然而，由于PODXL主要參與形成電荷屏障，敲低PODXL后是否對(duì)毛細(xì)血管通透性產(chǎn)生影響目前尚未明確；此外，本研究僅研究了p-ezrin、RhoA信號(hào)通路，至于PODXL對(duì)其他信號(hào)通路是否產(chǎn)生影響，亦需進(jìn)一步研究以明確。最后，由于本研究為體外實(shí)驗(yàn)，尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

小結(jié)：PODXL是維持足細(xì)胞骨架穩(wěn)定性的重要條件， 敲低PODXL基因或使用Ezrin抑制劑抑制ezrin磷酸化后，p-ezrin表達(dá)下調(diào)、RhoA活性降低，導(dǎo)致足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂、促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。從而說明PODXL基因敲低后引起足細(xì)胞損傷可能與p-ezrin、RhoA信號(hào)通路有關(guān)。