基于多元統(tǒng)計方法和頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對瓜馥木不同部位揮發(fā)性成分的比較研究＊

胡海波，李耀利，程庚金生，鄧婧怡，李加林，程齊來，黃 浩

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 贛州 341000；2. 北京大學(xué)藥學(xué)院 北京 100191；3. 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心客家中醫(yī)藥資源研究分中心 贛州 341000；4. 魯汶大學(xué)動物研究所 魯汶 3000）

番荔枝科植物瓜馥木Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.主要分布于我國長江以南多省[1]，首載于《植物名實圖考》，謂之廣香藤，曰：“產(chǎn)南安（今江西省贛州市大庾嶺附近的南安），綠葉毛澀，黃背赭紋，極似各樹寄生，惟褐莖長勁為異。俚醫(yī)用以解毒、養(yǎng)血、清熱[2]?！薄吨腥A本草》亦收載為廣香藤，以干燥根入藥，性平、味微辛，具祛風(fēng)除濕、活血止痛等功效，可用于治療風(fēng)濕痹痛、腰痛、胃痛、跌打損傷等癥[3]。實地調(diào)查表明客家地區(qū)多使用瓜馥木地上部分，用于治療和預(yù)防婦科和產(chǎn)科炎癥等，稱為“香藤”，與記載的廣香藤用根存在差異[4]。瓜馥木主要含有生物堿、黃酮、類黃酮-倍半萜雜合結(jié)構(gòu)、呋喃酮類、環(huán)戊烯酮類、苷類、有機酸、揮發(fā)油等成分，其中生物堿、黃酮和有機酸類成分具有較高的生物活性[5,6]。藥理學(xué)研究證明其中的有機酸具抗關(guān)節(jié)炎作用，生物堿具鎮(zhèn)痛作用和心血管生物活性，可用于治療心律不齊與慢性心肌供血不足，生物堿亦有抗腫瘤活性，對W256、S37、S180等瘤株有抑制作用等[7-11]。

目前對于瓜馥木揮發(fā)性成分的研究中，均是基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析超臨界CO2流體和水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油，僅采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫定性[12,13]。為此，本文首次采用頂空氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-GC-MS）直接對瓜馥木藥材的粉末進行揮發(fā)性成分分析，并結(jié)合程序升溫保留指數(shù)（RI 值）進行定性，并基于XCMS-online軟件對不同樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行提取和對齊，以提高定性準(zhǔn)確性；同時針對藥用部位的藥用差異問題，運用偏最小二乘法判別分析法（PLS-DA）、及正交校正的偏最小二乘分析法（OPLSDA）兩種多元統(tǒng)計分析方法進行數(shù)據(jù)的分析和比較不同部位揮發(fā)性成分，首次探討瓜馥木揮發(fā)性成分的分布差異性。研究結(jié)果將為該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)制定和民間使用提供依據(jù)和借鑒，并為進一步的藥效評價、資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Shimadzu QP2010 PLUS型GC-MS聯(lián)用儀（日本島津公司）；CP9205型氣相色譜柱（Agilent，VF-WAXms，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；2.5 mL 頂空針（德國Hamilton 公司）；18-09-1307-TF 型頂空氣相小瓶（日本島津公司，配備有硅酮/PTFE 隔墊和磁性瓶蓋）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市光明醫(yī)療儀器有限公司）；BO-500Y型多功能粉碎機（永康鉑歐五金廠）；2號和3號藥典篩（思科儀器紗篩廠）；AB135-S 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）。正構(gòu)烷烴（C7-C30）標(biāo)準(zhǔn)溶液（SIGMA-ALDRIC 批號：XA17133V）。實驗用瓜馥木藥材由贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院胡海波老師于2016 年11 月采于江西省崇義縣陽嶺國家森林公園，并鑒定為番荔枝科瓜馥木屬瓜馥木Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.的干燥植株（編號XT-CY1601），憑證標(biāo)本保存于贛南醫(yī)學(xué)院中藥標(biāo)本館。

2 方法

2.1 瓜馥木藥材粉末樣品的制備

將采集的新鮮瓜馥木根、莖、葉、蟲癭（多見，莖上）4 個部位分離，置于烘箱中在40℃條件下干燥。粉碎機粉碎，過藥典篩2-3 號篩（24-50 目），取中間粉末混勻。各部位樣品重復(fù)取樣6次，分別命名為G1-G6、J1-J6、Y1-Y6、CY1-CY6。

2.2 HS-GC-MS條件

精密稱取0.1 g 瓜馥木各部位粉末，置于10 mL 頂空瓶中。在100℃下加熱30 min，振蕩器轉(zhuǎn)速250 rpm，頂空進樣體積1 mL，進樣針溫度120℃，針清洗時間10 min。

色 譜 柱Agilent VF-WAXms（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）；載氣為高純氦氣（＞99.999%），流量為1.2 mL·min-1。進樣口溫度230 ℃，分流比20:1，柱溫35℃，柱流量1 mL·min-1，升溫程序：35℃保持3 min，以5℃·min-1升到220℃，保持5 min，以20℃·min-1升到240℃，保持2 min。

離子源為EI 源，離子源溫度：200℃；接口溫度：230℃。溶劑切割時間：1.00 min。掃描方式：Scan 模式，分子量掃描范圍：35-600 amu，掃描速率0.30 s/scan。離子化能量70 eV。

圖1 瓜馥木不同部位揮發(fā)性成分總流離子圖

2.3 定性和半定量分析

使用島津氣質(zhì)工作站（GCMS solution Version 2.70）對以上條件得到的GC-MS 數(shù)據(jù)進行解析：所得瓜馥木中成分的質(zhì)譜裂解圖與NIST11、NIST11s 質(zhì)譜裂解庫及文獻中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對；通過正構(gòu)烷烴混標(biāo)（C7-C30）方法計算各化合物的保留指數(shù)（RI）[14-17]，并與美國國家標(biāo)準(zhǔn)局建立的NIST Chemistry WebBook 在線查詢系統(tǒng)中的文獻值和其它文獻值進行對照。

利用XCMS-online[18,19]在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輔助定性：將GC-MS 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成cdf 格式后上傳到XCMS-online 在線分析系統(tǒng)，基于荷質(zhì)比和保留時間對離子碎片進行數(shù)據(jù)對齊分析，并轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)為Excel格式后進行人工的篩零處理，排除平行進樣中的單次進樣誤差和輔助找出特異性成分。

利用SMICA-P 軟件進行多元統(tǒng)計方法進行半定量分析：將上述對齊和排零后得的數(shù)據(jù)，進行PLS-DA分析和OPLS-DA 分析。獲得VIP 大于1 的數(shù)據(jù)，即組間顯著差異的主要成分信息，并以其碎片離子的強度作為半定量指標(biāo)，完成差異成分的相對含量比較[20，21]。

3 結(jié)果與討論

3.1 GC-MS定性分析

依照上述條件對瓜馥木不同部位共24 份樣品的揮發(fā)性成分進行分析，得出的總離子流圖（圖1）。經(jīng)質(zhì)譜解析共鑒定出41 個揮發(fā)性成分（表1），它們的峰面積之和占總峰面積的90%以上（根、莖、葉和蟲癭分別為94.52%、91.48%、90.79%、90.96%），可以反映瓜馥木樣品中揮發(fā)性成分的總體特征。從圖中可看出，24 份樣品中的大量成分已被表征出，且主要色譜峰均得到較好的分離；通過XCMS online 表征出不同顏色的樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，揮發(fā)性成分在不同部位中存在顯著差異，葉的成分強度明顯高于其他部分，可能是由于葉具有較多的油細胞[4]而分泌出的成分。

表1 瓜馥木不同部位揮發(fā)性成分

從瓜馥木不同部位中共鑒定出19種共有成分，分別為莰烯、2-已烯醛、β-羅勒烯、p 傘花烴、順-3-己烯醇、(-)α-蓽澄茄油烯、α-可巴烯、β-波旁烯、苯甲醛、芳樟醇、β-石竹烯、α-石竹烯、γ-衣蘭油烯、α-松油醇、巴倫西亞橘烯、(+)-雙環(huán)大根香葉烯、橙花叔醇、雪松醇、桉油烯醇。

其次，不同部位間存在22 種差異性成分，這些成分僅在瓜馥木的某個部位或某幾個部位被檢測到。如白菖烯、2-甲基四氫呋喃-3 酮僅在瓜馥木蟲癭、莖的揮發(fā)性成分中；β-羅勒烯僅在莖、葉的揮發(fā)性成分中；正己醛和長葉烯則僅在根中未被檢測到（表1）。

圖2 瓜馥木不同部位的24份樣品PLS-DA（a上圖）和OPLS-DA得分圖（b下圖）

3.2 不同部位的多元統(tǒng)計分析比較

由上述可見，瓜馥木不同部位間的成分差異明顯。為更好比較分析部位間差異，對獲取的GC-MS數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，包括最小二乘法判別分析方法（PLS-DA）和正交校正的偏最小二乘分析方法（OPLSDA）?；舅枷胧歉鶕?jù)已知樣品集特征，選定適合的判別準(zhǔn)則，建立成分表達量和樣品之間的關(guān)系模型來實現(xiàn)對樣品類別的預(yù)測和判斷分析。將XCMS online導(dǎo)出的excel 數(shù)據(jù)進行除零處理后，導(dǎo)入SIMCA-P 軟件上建模，利用PLS-DA 分析方法篩選不同模型后的自動擬合求解，預(yù)測后創(chuàng)建PAR 模型，R2X= 0.922,R2Y= 0.908,Q2= 0.899。其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2標(biāo)示模型的預(yù)測能力，理論上R2、Q2數(shù)值越接近1 說明模型越好[20-22]。PLS-DA模型建立成功，24份瓜馥木樣品明顯聚集成4類，即4個藥用部位，結(jié)果表明部位間的揮發(fā)性成分差異明顯，但莖的聚類效果欠佳（圖2-a）。

因此，為去除自變量X中與分類變量Y無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息主要集中在主成分中，模型變得簡單和易于解釋[23]，同時也為了獲得和驗證導(dǎo)致組間顯著差異的相關(guān)成分信息，進一步開展OPLS-DA 分析，創(chuàng)建PAR 模型后自動擬合獲得R2X= 0.957,R2Y=0.993,Q2= 0.98，說明模型建立良好。24 份瓜馥木樣品在OPLS-DA 分析方法中4 個部位各聚集成一類，在創(chuàng)建模型下部位間的差異較PLS-DA 方法中更為顯著（圖2-b）。

在圖2 中可以清楚地看到瓜馥木4 個部位揮發(fā)性成分的離散度。除了莖的數(shù)據(jù)分散程度比較大，葉、根和蟲癭的6組數(shù)據(jù)都聚為一類，結(jié)果顯示瓜馥木根、葉和蟲癭的揮發(fā)性成分存在明顯差異。

3.3 共有成分的半定量分析

基于上述結(jié)果，我們采用判別結(jié)果更優(yōu)的OPLSDA 方法計算各部位間差異。即通過計算變量投射重要度[20,21（]Variable Importance for the Projection，VIP）衡量各成分的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助差異性標(biāo)志物的篩選（即VIP值＞1.0）。

運用OPLS-DA 分析除零后的數(shù)據(jù)，自動擬合生成散點載荷圖（圖3），距離子簇較遠的碎片離子具更高的VIP值，預(yù)示著標(biāo)記物的存在。篩選出VIP值大于1 的離子碎片。根據(jù)這些離子的保留時間和質(zhì)荷比在GC-MS數(shù)據(jù)中靶向查找，整理出與之對應(yīng)的共有成分（表2）。并計算各離子碎片在不同部位（每個部位6組平行數(shù)據(jù)）的強度平均值，作為相對含量（%）的比較基準(zhǔn)。

圖3 瓜馥木不同部位的24份樣品OPLS-DA散點荷載圖

表2 瓜馥木不同部位揮發(fā)性成分相對含量的比較

4 結(jié)論

本文首次采用頂空氣相質(zhì)譜聯(lián)用方法對24 份瓜馥木不同部位的藥材粉末進行揮發(fā)性成分分析，并結(jié)合正構(gòu)烷烴混標(biāo)方法計算各成分RI值輔助定性，較先前報道僅數(shù)據(jù)庫比對更為準(zhǔn)確。其次，利用XCMS online 軟件對多次進樣的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)對齊處理，排除了單次進樣誤差和多次手動比對誤差。同時采用SMICA-P 軟件對GC-MS 表征的不同樣品成分進行PLS-DA、OPLS-DA 方法的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和比較分析，獲得了準(zhǔn)確的不同部位間差異成分結(jié)果。分析表明，瓜馥木不同營養(yǎng)器官（根、莖、葉、蟲癭）間的揮發(fā)性化學(xué)成分存在明顯差異。

結(jié)果顯示瓜馥木揮發(fā)性成分主要是烯烴類和脂肪烴衍生物類，因采用進樣和數(shù)據(jù)分析方法與先前研究不同，結(jié)果與文獻報道存在不少差異[10,12,13]。共定性出41種揮發(fā)性成分，根、莖、葉和蟲癭分別含有24、38、35 和25 種，其中共有組分19 種。值得注意的是，共有組分在瓜馥木不同部位含量差異顯著。如：莰烯在根中含量最高；β-石竹烯幾乎只存在于葉子中，相對含量超過90%，且β-石竹烯屬于單萜類化合物，是一種植物通訊信號分子，與植物防御啟動密切相關(guān)[24]，但莖在受蟲感染后形成的蟲癭中卻相對含量極低，可能是因為葉中的分泌組織更為豐富的緣故[4]，具體原因值

得關(guān)注研究；α-蒎烯可以異構(gòu)化并脫氫形成對傘花烴（具有祛痰和抗炎作用），同時α-蒎烯還可通過催化加氫生成蒎烷，再經(jīng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成芳樟醇[25,26]，瓜馥木揮發(fā)油中同時含有α-蒎烯、對傘花烴和芳樟醇，因此猜測在瓜馥木中可能含有某生物酶能將這幾種化合物進行轉(zhuǎn)化，值得進一步研究的價值。本研究屬于代謝組學(xué)方法在中藥質(zhì)量研究方面的應(yīng)用[27-29]，研究結(jié)果將為瓜馥木藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)制定和民間使用提供依據(jù)和借鑒，并為深入比較瓜馥木不同藥用部位的藥理作用及資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

致謝衷心感謝北京大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究室劉廣學(xué)老師在實驗過程中所提供的指導(dǎo)和幫助。