活血消癭方標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價研究＊

葉利春，肖靜霞，柳 暢，鄭國華，石召華，王桂紅＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 武漢愛民制藥股份有限公司 鄂州 436070；3. 湖北李時珍藥物研究院 鄂州 436070）

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（簡稱結(jié)甲）是臨床最為常見的甲狀腺疾病的一種,西醫(yī)針對結(jié)甲的治療方法有手術(shù)、甲狀腺激素抑制等，手術(shù)治療存在意外如損傷喉部神經(jīng)而導(dǎo)致音啞等風(fēng)險和并發(fā)癥，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，臨床上針對治療結(jié)甲的藥物多為化學(xué)激素類，該類藥物副作用大，且容易復(fù)發(fā)[1-4]。節(jié)甲從中醫(yī)學(xué)角度為“癭病”[5,6]，主要病機是氣滯痰凝血瘀，而引起的患者頸部腫大，腫塊堅韌疼痛，口黏多痰等癥，其形成緩慢且時間較久。故主要以活血消癭，兼疏肝理氣、清熱解毒為治療方法[7]，活血消癭方為湖北省名老中醫(yī)陳如泉教授多年研究治療結(jié)甲臨床經(jīng)驗方，方中由柴胡、王不留行、桃仁、莪術(shù)、蜣螂蟲、土鱉蟲、蜈蚣、貓爪草8 味入藥，具有活血化瘀、軟堅化痰、散結(jié)消腫的功效[8,9]。已作為醫(yī)院制劑活血消癭片在臨床上使用近20 年，療效顯著，深受廣大結(jié)甲患者歡迎?，F(xiàn)有醫(yī)院制劑活血消癭片將柴胡、王不留行、桃仁、莪術(shù)、蜣螂蟲、貓爪草6 味藥按《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》煎煮，將土鱉蟲和蜈蚣兩味藥打粉過篩后壓片包衣成藥。擬對醫(yī)院制劑活血消癭片進行新藥開發(fā)實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)，保證其質(zhì)量療效一致情況下，降低患者用藥成本，作為治療結(jié)甲專用藥廣泛推廣臨床使用。

中藥復(fù)方是多味藥組方而成，其關(guān)鍵難點在于復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究及過程質(zhì)量控制，目前大部分的中藥質(zhì)量控制僅依靠終端標(biāo)準(zhǔn)檢驗或個別化學(xué)成分控制，存在很大的局限性，2016 年國家藥品監(jiān)督管理部門發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》和2017 年發(fā)布的《中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定（征求意見稿）》中提出了“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”的概念，即標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按照臨床湯劑煎煮流程的規(guī)范化操作，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮的方法干燥制得；以古代醫(yī)籍中記載的經(jīng)典名方制備方法為依據(jù)制備的濃縮浸膏或凍干品[10]。而這兩個概念表述的質(zhì)量控制理念相似，均表示在傳統(tǒng)中藥大生產(chǎn)過程中，標(biāo)準(zhǔn)湯劑是作為參照物的作用。日本漢方藥多來源于中國古代經(jīng)典名方，其中對內(nèi)服制劑提出了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的概念，要求制定標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)與生物學(xué)的基準(zhǔn)。對于中間體及成品應(yīng)提供化學(xué)、生物學(xué)上與標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有統(tǒng)一性的研究資料，確?；瘜W(xué)成分及藥效作用與標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有一致性[11]。針對標(biāo)準(zhǔn)湯劑中“標(biāo)準(zhǔn)”研究，主要是將中藥材的產(chǎn)地、基源、提取工藝的統(tǒng)一性及質(zhì)控等建立標(biāo)準(zhǔn)。本研究遵循“原處方、原工藝，原用法”[12，13]，通過對標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分含量測定、指紋圖譜研究[14-17]，建立活血消癭片商業(yè)化生產(chǎn)的中藥材、制備工藝、規(guī)格等的標(biāo)準(zhǔn)體系，旨在建立評價工業(yè)化生產(chǎn)的工藝和質(zhì)量控制可控、有效的質(zhì)量體系，保證其與傳統(tǒng)的醫(yī)院制劑的一致性，保證其療效。

表1 15批樣品中各味藥材來源及批號

1 材料

1.1 儀器

沃特世e2695 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司，2489型紫外檢測器）；安捷倫1260Infinity 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，G1329B 型自動進樣系統(tǒng)，G1316A 型柱溫箱，G4212B 型DAD 檢測器），色譜柱：Waters XSelect ? HSS T3（4.6×250 mm，5 μm）；XSE 205 型電子分析天平（METTLER TOLEDO）；HHZK 6 型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TD 5A-WS 型臺式低速離心機（上海維爾康湘鷹離心機）；KQ-500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

苦杏仁苷對照品（含量以90.7%計，批號110820-201607，購自中國藥品生物制品檢定院）、王不留行黃酮苷對照品（含量以92.6%計，批號111853-201303，購自中國食品藥品檢定研究院）去甲氧基姜黃素對照品（批號112003-201501，購自中國食品藥品檢定研究院）、雙去甲氧基姜黃素對照品（批號112004-201501，購自中國食品藥品檢定研究院）、柴胡皂苷B1 對照品（批號18042831，購自同田生物）、柴胡皂苷B2 對照品（批號18042531，購自同田生物）、刺桐堿（18042532，同田生物）、吉馬酮（批號MUST-15051913，成都曼思特生物科技有限公司）甲醇、乙腈為色譜純（TEDIA 公司），實驗室自制超純水，其他試劑為分析純?；钛`顆粒是由武漢愛民制藥股份有限公司研發(fā)中試驗證車間生產(chǎn)所得（批號分別為H170527、H170528、H170530）。

蜣螂、王不留行、桃仁、莪術(shù)、貓爪草、柴胡6 味藥材分別采自主產(chǎn)區(qū)、道地產(chǎn)區(qū)及GAP 基地，湖北、河南、河北、甘肅等地，包括符合《中國藥典》要求的不同商品規(guī)格等級。藥材來源及批號見表1。經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定，研究樣品分別為金龜子科昆蟲屎殼螂Catharsiusmolossus Linnaeus的干燥體（蜣螂）、石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke 的干燥成熟種子（炒王不留行）、薔薇科植物桃Prunus persica(L.)Batsch的干燥成熟種子（燀桃仁）、姜科植物廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang 的干燥根莖（莪術(shù)）、毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatusThunb.的干燥塊根（貓爪草）、傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根（柴胡）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

按活血消癭方處方分別稱取各味藥材共15批，每個處方量藥材850 g，分別加8 倍量水浸泡30 min，加熱煎煮30 min，100 目濾布過濾，藥渣再加6 倍量水加熱煎煮30 min，100 目濾布，合并濾液，濾液采用4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，低溫濃縮至約1 000 mL，置1 000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取本品搖勻，精密量取6 mL，加24 mL 甲醇溶解，置4 000 r·min-1離心5 min，取上清液置蒸發(fā)皿中，水浴蒸至約2 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號HXXYP-01-HXXYP-15）

1.4 飲片供試品溶液的制備

1.4.1 桃仁

精密稱取本品粗粉約0.3 g置具塞錐形瓶中，加石油醚（60-90℃）50 mL，加熱回流1 h，冷卻至室溫，濾過，棄去石油醚液，藥渣及濾紙揮干溶劑，放入原錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密量取，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至室溫后稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.4.2 王不留行

精密稱取本品粉末（過三號篩）約1.2 g 置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫后稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 浸膏供試品溶液的制備

稱取活血消癭浸膏適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加25%甲醇水溶液，稱定重量，超聲20 min（功率300 W，頻率為40 kHz），放冷至室溫，再稱定重量，用25%甲醇溶液補足減失重量。置4 000 r·min-1離心5 min，取上清液置蒸發(fā)皿中，水浴蒸至約2 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表2 15標(biāo)準(zhǔn)湯劑各檢查項結(jié)果

表3 含量測定梯度洗脫條件

2 方法及結(jié)果

2.1 pH及相對密度的測定

分別取混合均勻的HXXYP01-HXXYP15 標(biāo)準(zhǔn)湯劑30-50 mL，用pH 計測定pH 值，15 批的標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH值在4.12-5.42 內(nèi)。用比重瓶法測定相對密度，15 批次的標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對密度應(yīng)為1.06-1.08（表2）。

2.2 總固體及出膏率測定

分別精密吸取混合均勻的HXXYP01-HXXYP15標(biāo)準(zhǔn)湯劑50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在105℃干燥3 h，蒸干溶劑后移至干燥器中，冷卻30 min，迅速稱定重量，即得。15 批次的標(biāo)準(zhǔn)湯劑總固體為165.69-212.25，出膏率為17.72-22.70?？偣腆w結(jié)果及出膏率結(jié)果見表2。3 批中試驗證生產(chǎn)的活血消癭方提取液的pH 分別為4.57、4.63、4.60，相對密度分別為1.07、1.06、1.07，總 固 體 為185.79g、186.23g、185.81g，出膏率為19.84%、19.95%、19.79%。結(jié)果表明活血消癭方生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，工藝研究放大可重復(fù)性良好。

表4 2種成分的含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果

2.3 樣品含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱為Waters XSelect?HSS T3（4.6×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，以0.3%磷酸溶液為流動相B，按表3 的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；流速為1 mL·min-1。理論塔板數(shù)按苦杏仁苷峰及王不留行黃酮苷峰計算均應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 飲片對照品溶液的制備

分別取苦杏仁苷、王不留行黃酮苷對照品適量，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL 含苦杏仁苷80 μg、含王不留行黃酮苷0.1 mg的溶液，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照品溶液的制備

取苦杏仁苷、王不留行黃酮苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含苦杏仁苷2.59 mg、王不留行黃酮苷0.65 mg 的溶液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3.2 項下”對照品溶液，配制成6 個梯度的質(zhì)量濃度注入液相色譜系統(tǒng)，測定色譜峰面積。分別以苦杏仁苷和王不留行黃酮苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），以對照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，苦杏仁苷及王不留行黃酮苷的線性回歸方程分別為Y=9 844 472X+709 345，Y=12 679 639X-124 246，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6，0.994，線性范圍分別為0.129-2.59 mg·mL-1，0.032 5-0.65 mg·mL-1，表明在各自的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗

精密量取“2.3.2項下”對照品溶液，連續(xù)進樣6針，按“2.3.1”項下條件進行測定，計算苦杏仁苷和王不留行黃酮苷色譜峰面積RSD 分別為0.68%、0.75%，保留時間RSD 分別為0.55%、0.62%，表明該儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗

取相同批號樣品（批號為HXXYP-15），按照“1.3”項下方法分別處理6份，按“2.3.1”項下色譜條件測定，測得苦杏仁苷和王不留行黃酮苷含量分別為1.77 mg·mL-1、0.26 mg·mL-1，RSD 分別為0.78%、0.95%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗

取“1.3”項下的樣品（批號為HXXYP-15），室溫放置，分別于0、2、4、8、16、24 h 取樣，按“2.3.1”項色譜條件測定，進樣量為10 μL，測得苦杏仁苷和王不留行黃酮苷含量的RSD 分別為1.02%、0.97%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 回收率

精密稱取已知含量的樣品（批號為HXXYP-15），按照2.2.1 項下方法制備，分別加入80%、100%、120%定量的苦杏仁苷和王不留行黃酮苷對照品溶液，測定3 次，測得苦杏仁苷和王不留行黃酮苷加樣回收率分別為98.3%和99.9%，RSD分別為1.5%和1.2%。

2.3.9 含量測定

取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，精密量取,注入高效液相色譜儀，按照“2.3.1”條件檢測，15 批的檢驗結(jié)果見表4，得到苦杏仁苷和王不留行黃酮苷含量范圍在1.08%-3.48%，0.17%-0.57%,轉(zhuǎn)移率范圍分別是53.4%-79.1%，51.85%-89.70%。3 批中試驗證生產(chǎn)的活血消癭方浸膏的苦杏仁苷和王不留行的黃酮苷的含量及轉(zhuǎn)移率在以上標(biāo)準(zhǔn)湯劑的范圍內(nèi)。

表5 指紋圖譜梯度洗脫條件

圖1 15批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

圖2 對照特征圖譜及共有峰的確認

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters XSelect?HSS T3（4.6×250 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，以純水為流動相B，按表5的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為250 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；流速為1 mL·min-1。理論塔板數(shù)按苦杏仁苷峰及王不留行黃酮苷峰計算均應(yīng)不低于3 000。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑定位對照品溶液制備

取刺桐堿、苦杏仁苷、王不留行黃酮苷、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、吉馬酮對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含取刺桐堿0.22 mg、苦杏仁苷2.51 mg、王不留行黃酮苷0.60 mg、柴胡皂苷B10.56 mg、柴胡皂苷B20.26 mg、雙去甲氧基姜黃素0.29 mg、去甲氧基姜黃素0.15 mg、吉馬酮1.27 mg的溶液，即得。

2.4.3 精密度考察

取HXXYP-15 標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按供試品方法制樣，連續(xù)進樣6次，按“2.4.1”項色譜條件進行測定，計算各特征色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 值，結(jié)果分別為0.16%-2.07%、0.04%-0.28%，表明該儀器精密度良好（以7號峰王不留行黃酮苷為參比峰）。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取HXXYP-15 標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按供試品方法制樣，按“2.4.1”項色譜條件測定，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 內(nèi)檢測，計算各特征色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 值，結(jié)果分別為0.32%-2.98%、0.04%-0.21%，表明室溫放置24 h，供試品溶液穩(wěn)定性良好（以7號峰王不留行黃酮苷為參比峰）。

2.4.5 重復(fù)性考察

取HXXYP-15 標(biāo)準(zhǔn)湯劑6 份，按供試品的制備方法制，按“2.4.1”項下色譜條件測定，計算各特征色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 值，結(jié)果分別為0.39%-2.54%、0.05%-0.25%，表明該方法的重復(fù)性良好（以7號峰王不留行黃酮苷為參比峰）。

2.4.6 特征圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定

按2.4.1 下色譜條件，分別吸取15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液各10 μL，精密量取，注入高效液相色譜儀，15 批次的標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜見圖1，其中R 為生成的對照圖譜，生成的對照特征圖譜見圖2，其中共有峰15個，指認出8個色譜峰。以峰7為參照峰，統(tǒng)計共有峰峰面積及保留時間，計算其他共有色譜峰的相對峰面積和相對保留時間（表6）。

表6 各共有峰的相對保留時間與相對峰面積結(jié)果

圖3 混合對照品溶液色譜圖

2.4.7 相似度評價

用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 年版本），對15批次的標(biāo)準(zhǔn)湯劑的實驗結(jié)果進行評價，根據(jù)軟件匹配確定15 個共有峰，因7 號峰（王不留行黃酮苷）的分離度良好，峰面積所占總峰面積比例適中，故選用其作為參考峰。15 批次活血消癭方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜相似度計算結(jié)果見表7，15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各批次的指紋圖譜與生成對照指紋圖譜的相似度分別 為0.968、0.930、0.965、0.960、0.967、0.968、0.948、0.983、0.978、0.969、0.969、0.951、0.975、0.904、0.998，均大于0.90。將三批中試驗證生產(chǎn)的活血消癭方浸膏與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對照指紋圖譜的相似度分別為0.992、0.994、0.994，均大于0.9，表明工業(yè)化生產(chǎn)樣品與傳統(tǒng)方法重復(fù)性良好。

3 討論

3.1 研究批次及藥材來源選擇

中藥材多來源于動植物，種質(zhì)資源、土壤、氣候、栽培和加工技術(shù)等因素均會對其質(zhì)量影響[18-19]，不同的藥材產(chǎn)地、采收期、產(chǎn)地加工等因素都有可能產(chǎn)生質(zhì)量風(fēng)險[20-22]，為降低藥材產(chǎn)生的影響，應(yīng)考慮不少于3個產(chǎn)地的不少于15批次藥材的質(zhì)量屬性進行分析研究，本研究中各味藥材分別采用全國5 個產(chǎn)區(qū)的藥材共15 批次研究，結(jié)果表明，以桃仁及王不留行藥材到標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分含量可看出，不同產(chǎn)地的桃仁及王不留行指標(biāo)成分的差異較大，且藥材的指標(biāo)成分含量高，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的成分較高，后續(xù)產(chǎn)業(yè)化過程中，應(yīng)當(dāng)選擇各味藥材指標(biāo)成分較高的產(chǎn)區(qū)，選用上好的藥材，保證其成品藥的質(zhì)量。

3.2 煎煮參數(shù)的選擇

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝包括煎煮、固液分離、濃縮、干燥步驟等。對于保證中藥的化學(xué)成分起著關(guān)鍵作用[23]。在煎煮藥材，選用口徑較小陶瓷材質(zhì)煎藥器具，較好的保留揮發(fā)性成分及水分，可提高效率以及保證藥物療效。不同的藥物質(zhì)地和藥性不同，加水量和煎煮時間也會對其產(chǎn)生較大影響，部分藥物的化學(xué)成分會隨著煎煮時間的延長而破壞[24]，易揮發(fā)的物質(zhì)會揮發(fā)而損失[25]，藥效也會影響，故本研究參照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中對中藥煎煮的要求，選擇第1 次煎煮加8 倍量水浸泡30 min，加熱煎煮30 min，第2次煎煮加6倍量水加熱煎煮30 min。

3.3 活血消癭方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的應(yīng)用

本研究通過對15 批活血消癭方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究，計算其pH 范圍4.12-5.42，密度為1.06-1.08，出膏率范圍在17.22%-22.70%，采用HPLC 法測定的標(biāo)準(zhǔn)湯劑的苦杏仁苷和王不留行黃酮苷含量范圍在1.08%-3.48%，0.17%-0.57%，轉(zhuǎn)移率分別在53.4%-79.1%，51.85%-89.70%。又采用HPLC 法建立了活血消癭方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，系統(tǒng)整體地反映標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的各組分情況。通過對活血效應(yīng)方的標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究，構(gòu)建活血消癭方產(chǎn)業(yè)化過程中中間體的質(zhì)量控制體系，充分體現(xiàn)了質(zhì)量源于設(shè)計的理念，該研究結(jié)果可為活血消癭方的工業(yè)化生產(chǎn)中間體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和過程質(zhì)量控制提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。