“譜效整合指紋圖譜技術(shù)”在中藥物質(zhì)基礎方面的研究進展及思考＊

朱 巖，戚 進，余伯陽

（中國藥科大學中藥學院 南京 211198）

中藥是上千年來我國民族醫(yī)藥發(fā)展的集中體現(xiàn)，也是現(xiàn)階段我國醫(yī)藥體系中的重要組成部分。傳統(tǒng)中藥在疾病治療方面特色顯著、療效明確，但現(xiàn)代中藥需要在傳統(tǒng)的基礎上發(fā)展與革新，以適應現(xiàn)代社會生產(chǎn)力進步的需要。在現(xiàn)代中藥研發(fā)過程中涉及到多方面的研究，其中中藥物質(zhì)基礎是影響中藥發(fā)展與創(chuàng)新的核心問題。

目前，中藥藥效物質(zhì)基礎在中藥研究中的重要性已被國內(nèi)外所廣泛認同，中藥物質(zhì)基礎的闡明對于中藥作用機制的深入、中藥質(zhì)量控制的制訂、中藥新藥研發(fā)的來源、以及中藥產(chǎn)品加工和生產(chǎn)過程中的指導等都具有極為深遠的意義。中藥藥效物質(zhì)基礎研究主要包括中藥藥效物質(zhì)的辨識、遴選和分離等方面，其中中藥藥效物質(zhì)的辨識既是中藥藥效物質(zhì)基礎研究的重點也是其研究的難點。由于中藥本身具有生物多效性和成分復雜性的特點，采用傳統(tǒng)的研究方法從豐富的次生代謝產(chǎn)物環(huán)境中辨識出藥效物質(zhì)需要耗費大量的人力、物力和時間，因此必須引入一些新的技術(shù)方法以解決現(xiàn)有中藥藥效物質(zhì)基礎研究中存在的問題，提高相應的研究效率。在最近20年的中藥物質(zhì)基礎研究方法中，“譜效相關”研究逐漸顯示出在中藥藥效物質(zhì)基礎辨識方面的潛力。

1 中藥“譜效相關”研究現(xiàn)狀與發(fā)展

“譜效相關”研究源于對中藥質(zhì)量控制的研究，其中“譜”主要指采用各種光譜學和色譜學技術(shù)建立的中藥指紋圖譜。最初“譜效相關”研究的提出主要是為解決中藥指紋圖譜不能完全實現(xiàn)質(zhì)量與藥效的關聯(lián)性，因而引入“效”的因素對其加以補充和完善，以期獲得更為合理的質(zhì)控方案。但在“譜效相關”研究不斷深入的過程中，該方面研究體現(xiàn)出了在生物學與化學信息關聯(lián)分析方面的優(yōu)勢，進而為解決中藥藥效物質(zhì)基礎辨識問題開啟了新的思路。目前“譜效相關”研究已基本形成了相關研究的主體模式，主要是以高效液相或氣相為主建立相關中藥的指紋圖譜，選擇一個或多個體內(nèi)或體外藥效學指標對多批次中藥的活性進行評價，采用灰色關聯(lián)度分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡和回歸分析等方法建立色譜峰與藥效指標間的聯(lián)系，實現(xiàn)“譜”與“效”的關聯(lián)。相關研究已有大量報道，為中藥藥效物質(zhì)基礎研究提供了可資借鑒的技術(shù)方法和科學數(shù)據(jù)。但與此同時，越來越多的學者也指出，盡管當前“譜效相關”研究已取得較大進展，但其還存在不少有待商榷的問題。譬如，當前大部分“譜效相關”研究中只是基于數(shù)學方法計算獲得的色譜峰與藥效的關聯(lián)系數(shù)，并不能獲得各色譜峰的藥效數(shù)據(jù)，對于數(shù)據(jù)結(jié)果的準確性和進一步分析的可能存在一定的限制。其次，當前處理譜效關聯(lián)的各種數(shù)學方法均存在著不同的優(yōu)勢和缺陷，尚未出現(xiàn)一種被廣泛認可的數(shù)學方法處理模式。此外，目前關于“效”的指標選擇存在著過于籠統(tǒng)、無針對性的問題，缺乏對藥效整體性評價的設計，關于多指標相關“效”的擬合方法，基本處于無研究或較為隨意處置的狀態(tài)。這些問題的解決還需要中藥物質(zhì)基礎方面的研究者進行更深入的探索。

本課題組在2003 年前后提出了“生物活性指紋”這一概念，在此基礎上于2010 年正式提出了“譜效整合指紋圖譜”這一譜效學研究模式的基本研究思路和方法。該研究擬通過構(gòu)建離線或在線的活性檢測方法，獲得所有指紋峰或峰群的活性數(shù)據(jù)，進而基于所獲得的活性信息構(gòu)建與中藥化學成分指紋峰相對應的活性指紋譜，再經(jīng)過統(tǒng)計分析或計算機處理，將不同的化學與生物學指紋信息整合后獲得可直觀反映中藥藥效物質(zhì)基礎的多信息圖譜模式（圖1）?；谠撃Ｊ?，本課題組在過去十多年的時間中，發(fā)展了多種離線或在線的活性檢測方法，對山楂葉、銀杏葉、淫羊藿、葛根、虎杖、金銀花、玄參、綠茶、黃芩、何首烏等20多種中藥/天然產(chǎn)物的物質(zhì)基礎和質(zhì)量控制進行了研究，在此本文對相關研究成果進行簡要總結(jié)，以期為基于“譜效相關”研究探索中藥物質(zhì)基礎提供參考。

2 在線/離線活性檢測方法的建立

抗氧化研究一直是中藥研究中的熱點問題，很多中藥的療效都與其對體內(nèi)自由基代謝的調(diào)節(jié)有密切關系。因此本課題組選擇從抗氧化的角度入手，進行離線或在線活性檢測方法的構(gòu)建。從分子層面來看，各種自由基及其活性衍生物、自由基來源的各種氧化酶、抗氧化的各種自由基相關清除酶構(gòu)成了自由基代謝的基本主體。不同中藥對其調(diào)節(jié)作用主要是通過直接清除自由基及其活性衍生物和對各種氧化酶和抗氧化酶的調(diào)節(jié)作用來實現(xiàn)的，因此需要根據(jù)指標的不同特性，分別設計相應的活性檢測方法。

圖1 “譜效整合指紋圖譜”研究的主體模式

2.1 清除自由基及其活性衍生物的在線活性檢測方法的建立

此外，DPPH 體系和ABTS 體系也是目前在抗氧化領域較為公認的檢測方法，盡管DPPH 自由基和ABTS自由基并非體內(nèi)內(nèi)源性自由基，但其被廣泛應用于對天然產(chǎn)物的活性評價。本課題組丁曉萍等[12]構(gòu)建了清除DPPH 自由基在線活性檢測方法，對銀杏葉的抗氧化物質(zhì)基礎進行了分析；孫莉瓊等[13]和張雷等[14]采用該方法，分別探討了國產(chǎn)兔眼藍莓和綠茶的抗氧化物質(zhì)基礎及相關質(zhì)控方法；高翔等[15]構(gòu)建了清除ABTS自由基在線活性檢測方法，對消癌平注射液中的抗氧化成分進行了分析總結(jié)；王宇卿等[16]基于上述方法，對生脈散和益氣復脈粉針抗氧化活性物質(zhì)進行比較分析，明確了二者抗氧化物質(zhì)基礎的差異。

上述所建立的方法均為在線活性檢測方法，在獲得高效液相色譜圖的同時即獲得了與色譜峰一一對應的活性指紋譜，方法靈敏、快速且操作簡便，為基于“譜效相關”探索中藥物質(zhì)基礎提供了思路和方法學的借鑒。

2.2 基于調(diào)節(jié)酶活性的半在線/離線活性檢測方法的建立

半在線/離線活性檢測方法與在線活性檢測方法相比，技術(shù)難度上要求相對簡單，適用面也更為廣泛。之所以采用半在線/離線模式，主要是基于兩方面的考慮。盡管高效液相色譜的分離能力較為強大，但是中藥復雜的次生代謝體系并不能確保每一個色譜峰均能實現(xiàn)基線分離，在此情況下，可采用對不同峰群進行劃段收集的方式，進行活性檢測后辨識其中主要的活性峰群。

本課題組劉榮華等[17-19]采用截峰收集的方法對山楂葉指紋圖譜上的各指紋峰進行了收集，檢測了不同濃度各指紋峰對中性粒呼吸爆發(fā)的抑制活性，基于不同濃度指紋峰峰面積和藥效之間的關系建立了相應數(shù)學模型，并擬合出了相應的生物活性指紋，明確了山楂葉抑制中性粒細胞呼吸爆發(fā)的藥效物質(zhì)基礎；牟玲麗和林以寧等[20,21]分別采用“缺失”峰策略制備了缺失特征性指紋峰和峰群的銀杏葉和麥冬樣品，比較了不同樣品抑制中性粒細胞呼吸爆發(fā)的活性，預測了銀杏葉和麥冬中主要的活性峰或峰群，并進一步采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡（BP-ANN）方法建立了譜效相關的分析和預測模型。

另一方面，中藥藥效物質(zhì)與酶作用反應的過程與清除自由基反應的過程不同，受反應環(huán)境的制約較多，此前本課題組所建立的在線活性檢測方法大多為柱后反應檢測活性，大部分酶類不耐有機試劑，洗脫液中的有機相容易引起蛋白變性，對細胞和酶類往往有一定損傷；其次，藥效物質(zhì)對酶作用一般需要一定的時間，因此對于基于酶活性的檢測方法一般多采用離線的檢測方法。常艷旭等[22]基于UHPLC/DAD/QTOF-MS 建立了金芪降糖片的指紋圖譜，采用收集指紋峰的方法，對各指紋峰清除DPPH 自由基活性，抑制α-糖苷酶、α-淀粉酶、醛糖還原酶和脂肪酶的活性進行了研究，結(jié)果表明金芪降糖片藥效物質(zhì)基礎中不同類型成分功能不同，酚酸類成分主要活性為清除自由基，生物堿和黃酮類成分均表現(xiàn)出對α-糖苷酶、α-淀粉酶、醛糖還原酶和脂肪酶的抑制活性，其中生物堿類物質(zhì)活性較強；孫莉瓊等[23]對柱后反應過程中黃嘌呤氧化酶活性受到的各種影響因素進行了考察，建立了收集流分后直接進行活性檢測的半在線活性檢測方法，該方法將在線檢測O和半在線檢測對黃嘌呤氧化酶抑制活性兩種功能融為一體，并成功運用于中藥黃芩和中藥方劑黃連解毒湯的藥效物質(zhì)基礎研究中。

超濾離心法是一種近年來在中藥研究中逐漸興起的新方法，方法簡便快速且易于操作。某種程度上，該方法也可以認為是另一種離線的“活性檢測”方法。超濾離心法的基本前提在于能與酶特異性結(jié)合的化學成分才是可能的藥效成分，但其反映的是酶與化合物之間的特異性親和作用而非藥效結(jié)果，因此一般采用該方法后仍需進行藥效驗證。王瑩等[24]采用超濾離心法建立了抑制髓過氧化物酶（MPO）活性檢測方法，并結(jié)合之前所進行了分析，并采用了動物模型進行了活性驗證，結(jié)果表明梔子中直接清除HOCl 的物質(zhì)基礎主要為環(huán)烯醚萜類和咖啡?？鼘幩犷惓煞?，抑制MPO活性的物質(zhì)則為梔子中西紅花苷類成分。

固定化酶技術(shù)使酶的穩(wěn)定性和重復使用性得到極大的提高，為酶在工業(yè)上的大規(guī)模運用提供了條件，載體作為固定化酶技術(shù)的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)及性能對固定化酶的催化活性及操作穩(wěn)定性產(chǎn)生直接影響，已經(jīng)成為固定化酶技術(shù)研究的熱點。王婷等[25]通過對氨基、羧基及N-羥基琥珀酰亞胺三種功能團修飾的商業(yè)化磁珠固定化黃嘌呤氧化酶（XOD）效率進行比較，選擇了最適合的氨基磁珠固定化XOD 進行表征和條件優(yōu)化，建立固定化XOD 配體垂釣的方法，并應用于生姜、黃芩和葛根中，從生姜和黃芩中成功篩選并鑒定出12個潛在的XOD配體。

總體而言，在線方法更為簡單、靈敏、快速，操作更為自動化，但其對指標的選取有一定受限條件；離線方法受指標選擇的影響相對較小，相對選擇范圍較大，但其操作較為繁瑣，兩種方法需結(jié)合實際情況進行選擇或結(jié)合使用。

3 數(shù)學方法的選擇及輸出模式

“譜效整合指紋圖譜”采用的策略為直接獲取各指紋峰或峰群的活性數(shù)據(jù)，其與化學成分的關聯(lián)性更為緊密。但是所獲得的活性數(shù)據(jù)多以抑制率的方式表征，難于體現(xiàn)對整體藥效的貢獻率，因此如何基于量化的方式準確評價各指紋峰對藥效的貢獻，仍然需要合理選擇相應的數(shù)學方法。此外，評價每一個指紋峰的活性強弱需要量效關系的計算，考慮到獲得所有指紋峰的對照品進行全成分定量的難度，需要合適的數(shù)學方法進行數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換。前期研究中本課題組提出了“效價”這一概念，通過建立陽性對照的量效關系方程，將不同指紋峰的活性代入該方程進行計算，獲得各指紋峰效價值，并以陽性對照的單位藥效作為效價單位，建立不同中藥的效價指紋圖譜。該圖譜在一定程度上可直觀顯示各指紋峰對整體藥效的貢獻，并可用于不同批次中藥的活性預測。

但是，中藥具有生物多效性和成分復雜性的特點，其治療某一種疾病的藥效往往是多種活性體現(xiàn)出的復雜綜合效應。這一綜合效應既包括同一層面的活性也包括不同層面的活性。這種復雜的非線性模糊關系阻礙了對其藥效的準確評估。在此背景下，本課題組首次提出了模糊數(shù)學結(jié)合層次分析法的方法用于同一層面活性的綜合評價。

上世紀60年代中期，美國學者首次提出模糊數(shù)學的概念，標志著其的誕生。近幾十年模糊數(shù)學發(fā)展異常迅速，已涉及到國民經(jīng)濟的各個領域，許多界限不分明甚至是很模糊的、不宜使用常規(guī)統(tǒng)計學的案例中，采用模糊數(shù)學都取得了較顯著的成果。層次分析法是將決策有關的元素分解成目標、準則、方案等層次，在此基礎之上進行定性和定量分析的決策方法。擅長于賦予不同指標合適的權(quán)重常數(shù)，常與模糊數(shù)學方法配合使用，通過建立相應的權(quán)重集，以便進一步的模糊數(shù)學計算。本課題組對茶葉和黃芩分別進行了譜效整合指紋圖譜研究，建立了不同來源茶葉和黃芩在線清除H2O2，O和·OH 的活性指紋，采用層次分析法構(gòu)建了對于清除H2O2，清除O和清除·OH 的權(quán)重集，并結(jié)合模糊數(shù)學運算，對茶葉和黃芩指紋圖譜中各指紋峰綜合抗氧化能力進行了評級，并根據(jù)評級結(jié)果選擇綜合抗氧化能力強的指紋峰，建立了相應的質(zhì)控方法[8]。這一方法的優(yōu)點在于，填補了目前國內(nèi)譜效相關研究中效的擬合部分的空白。

在譜效相關研究中通過采用多種數(shù)學分析方法，其中主要包括：回歸性分析、灰色關聯(lián)度分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡等，把代表中藥化學成分特征的“譜”和發(fā)揮藥物活性的“效”有機的聯(lián)系起來以實現(xiàn)中藥譜效的最終關聯(lián)。在譜效關聯(lián)分析中，應根據(jù)實驗對象的性質(zhì)與要求，選擇合適的方法，以期達到實驗的最終目標。

回歸分析（RA）是最常用的用于處理因變量和自變量之間關系的統(tǒng)計學方法之一。由于中藥指紋圖譜不只一個共有峰或特征峰，因此實際運用中多采用多元線性回歸和多元非線性回歸這兩種方法探究中藥“譜”與“效”之間的關系。而前者又較為常用，主要包含逐步回歸法、強迫引入法、強迫剔除法、前向逐步法、后向逐步法[26]。嚴丹等[27]采用多元線性回歸分析對檳榔提取物HPLC 指紋峰和其在體外促進腸平滑肌收縮的關系進行譜效研究，確定了檳榔促進十二指腸收縮的主要藥效物質(zhì)基礎。張靜等[28]采用多元回歸分析和雙變量相關分析探求紅花不同提取物配伍當歸-川芎藥對超臨界提取物（AC-SFE）的共有指紋峰相對峰面積與其抗心肌缺血作用的譜效關系，從AC-SFE中得到8 個可能的抗心肌缺血藥效物質(zhì)，該方法為復方配伍機制研究和藥效物質(zhì)基礎發(fā)現(xiàn)提供了依據(jù)。余婧等[29]對廣東紫珠指紋圖譜數(shù)據(jù)和其止血作用結(jié)果采用逐步引入法回歸分析，論證了苯乙醇苷類和黃酮類成分是廣東紫珠發(fā)揮止血作用的有效成分。

偏最小二乘回歸（PLSA）融合主成分分析、多元線性回歸分析及典型相關分析的基本功能為一體，實現(xiàn)對數(shù)據(jù)信息充分挖掘，并具有預測精度較及模型易于解釋等特點，是中藥譜效相關研究工作中的一種有效方法[30,31]。劉淼等[32]采用UPLC-Q-TOF/MS 法建立黑瑪咖8種提取物的指紋圖譜，采用PLSA對指紋圖譜的特征峰和其抗疲勞作用進行關聯(lián)度分析，確定其主要藥效成分，該方法為黑瑪咖藥效物質(zhì)基礎的深入研究和質(zhì)量控制方法的建立提供思路。李昌勤等[33]基于ABTS、DPPH 和FRAP 法測定恒溫加速法處理的女貞子抗氧化能力，對女貞子量化特征圖譜和抗氧化活性數(shù)據(jù)分別進行PLSA 分析，成功篩選出其抗氧化相關色譜峰。張弦飛等[34]對枸杞子提取物大孔樹脂水、30%、60%、90%乙醇洗脫部位抗氧化活性進行測定，測定60%洗脫部位抗氧化活性最好，基于此法采用UPLC-MS/MS 建立30 批次不同來源枸杞子指紋圖譜，并結(jié)合其清除DPPH和ABTS活性的實驗數(shù)據(jù)，研究其譜效關系，該方法的成功應用為枸杞子進一步開發(fā)和利用提供有力參考。

灰色關聯(lián)度分析（GRA）是系統(tǒng)中多因素相互關聯(lián)性的一類統(tǒng)計分析方法，參考與因素相關的樣本數(shù)據(jù)對各因素間關系的強弱、大小和次序進行定量描述，若樣本數(shù)據(jù)反映兩者因素變化的大小、方向和速度等基本一致，則兩間的關聯(lián)度較大；反之，彼此關聯(lián)度較小。楊冰月等[35]采用灰色關聯(lián)度分析法對半夏及其炮制品總有機酸HPLC 指紋圖譜與止咳的多個評價指標的關系進行分析，通過譜效關系闡明半夏及其炮制品發(fā)揮止咳作用的物質(zhì)基礎，為其質(zhì)量控制與評價提供理論依據(jù)。林夢雅等[36]運用灰色關聯(lián)度法建立丹參不同提取物的UPLC 圖譜特征峰與其抗炎藥效作用的譜效關系，最終確定4種主要藥效成分，為成分的定量和藥效評價提供指導，為丹參抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎提供思路。肖瑞瑤等[37]基于GC-MS 研究各種來源艷山姜揮發(fā)油化學成分，采用灰色關聯(lián)度法建立成分指紋圖譜與其抗炎鎮(zhèn)痛活性間的譜效關系，該方法為艷山姜活性成分的發(fā)現(xiàn)提供了新穎思路，并為深入研究和建立其質(zhì)量標準提供理論依據(jù)。池婕等[38]選擇灰色關聯(lián)度法分析雷公藤多苷片醋酸乙酯提取物指紋圖譜與淋巴細胞增殖抑制藥效數(shù)據(jù)的關系，實驗表明雷公藤增值抑制藥效作用是多成分共同起效的結(jié)果，為深入研究雷公藤藥效物質(zhì)基礎及制定科學的質(zhì)控評價標準提供參考。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡（ANNs）是一種模仿動物大腦思維行為特征，進行分布式并行信息處理的算法數(shù)學模型。這種網(wǎng)絡依靠高度復雜的系統(tǒng)，通過調(diào)整內(nèi)部大量節(jié)點之間相互連接的關系，從而達到快速處理信息的目的，且具有自學習和自適應能力。李偉霞等[39]通過多指標綜合指數(shù)法對當歸川芎藥對不同配比組方的3 種功效分別進行藥效指標的標化和整合，采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡對所測主要效應成分含量與其3種功效的整合效應分別進行擬合分析，闡釋方藥不同功效的效應物質(zhì)基礎及其對整方功效的貢獻大小，為探究中藥復方復雜效應物質(zhì)基礎提供新的方法與思路。尹永芹等[40]采用神經(jīng)網(wǎng)絡研究香丹注射液抗心肌缺血有效成分的譜效關系，確定其抗心肌缺血的主要成分并為其深入研究提供參考。許雯雯等[41]將氣滯胃痛顆粒中6 味藥材通過拉丁超立方法隨機采樣成不同比例組，進行體外抗炎活性研究，用灰色關聯(lián)度對藥效信息和各組HPLC 指紋圖譜的化學信息進行相關性分析，得出與抗炎活性密切相關的化學成分，并運用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡建立抗炎活性的預測模型，以便更好地評價氣滯胃痛顆?？寡椎恼鎸嵥幮?。以上實驗結(jié)果均表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡在復方成分的藥效學研究，具有一定的實用價值。

4 展望

中藥“譜效整合指紋譜”這一譜效學研究模式是在“生物活性指紋”這一概念基礎上提出的，是將中藥化學鑒別與活性評價融為一體，能較為全面地反映中藥復雜成分體系所各自對應的化學信息和生物活性信息，對中藥質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎的新發(fā)現(xiàn)均具有極其重要的理論意義與指導意義。同時，該方法也是中醫(yī)藥學者在中藥物質(zhì)基礎研究領域中的又一次深入探索和發(fā)現(xiàn)。但是，現(xiàn)存的各種研究方法都有其局限性，需要在日后的應用中不斷地加以補充和完善。“譜效整合指紋譜”包括了對中藥成分“譜”和藥效活性“效”的整合，即通過采用多種活性評價方法或選取符合中藥材臨床作用特點的指標，注重多學科的交叉應用，實現(xiàn)“譜”與“效”的真正相關性，只有正確把握中藥的整體性，才能充分發(fā)揮中藥療效。隨著中藥物質(zhì)基礎研究關聯(lián)基礎工作—藥物分析、中藥化學、藥理學等的擴展與深入，現(xiàn)代分析技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法的快速發(fā)展與更新，中藥譜效關系研究必將會在中藥物質(zhì)基礎的辨識、遴選和分離等方面做出卓越貢獻，進而推動祖國中醫(yī)藥事業(yè)的現(xiàn)代化和國際化。