川黃連多指標(biāo)成分定量及特征圖譜建立研究＊

吳曉青，時曉媞，蔣合眾，魏 屹，任瑤瑤，譚 睿

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031）

黃連（Coptidis Rhizoma）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為歷代醫(yī)家常用清熱燥濕的首選藥之一。《中華人民共和國藥典》（2015 版）收載黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch、三角葉黃連Coptis deltoideaC． Y． Cheng et Hsiao．或云連Coptis teetaWall．的干燥根莖[1]。主產(chǎn)于四川、重慶、貴州、西藏、湖南、云南、陜西等省區(qū)，川黃連一直以來被認為是黃連的道地產(chǎn)區(qū)，因基源不同，藥材分為“味連”、“雅連”和“鳳尾連”。

黃連根莖中含小檗堿、黃連堿、表小檗堿、甲基黃連堿、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、小檗紅堿、木蘭花堿、格陵蘭黃連堿等[2]。其含量測定方法主要有薄層掃描法、高效液相色譜法等。文獻報道的采用HPLC測定黃連及其炮制品中生物堿含量的方法，最多同時測定6個主要生物堿含量，且多集中于味連[3-6]，未能區(qū)分不同種黃連的品質(zhì)。本文采用RP-HPLC 建立了黃連中7個小檗型生物堿的含量測定方法，比較了味連、雅連和峨眉野連3 種川產(chǎn)藥材的7 個生物堿含量的差異，通過含量的差異來評價不同種川產(chǎn)黃連的品質(zhì)。川黃連由于生長環(huán)境、氣候條件等因素其物質(zhì)基礎(chǔ)存有差異，指紋圖譜分析方法作為控制黃連藥材的質(zhì)量方法之一，現(xiàn)有文獻報道中多以味連為研究對象建立指紋圖譜[7-9]，而對雅連和鳳尾連研究較少[10]。本文擬建立川產(chǎn)味連、雅連、鳳尾連的HPLC 特征圖譜，以對比3 個品種之間的差異，為川產(chǎn)黃連的品質(zhì)評價提供實驗數(shù)據(jù)支撐。

1 川黃連7個生物堿成分含量測定

1.1 材料

Angilent1260-II 型高效液相色譜儀；BS-110S 電子分析天平（北京賽多利斯電子天平有限公司）；超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

格陵蘭黃連堿、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀購于成都普思生物生物科技有限公司（批號分別 為 PS161130-03、PS161130-01、PS161124-01、PS161201-01、PS161130-02，含量≥98%），非洲防己堿購于成都曼斯特生物科技有限公司（批號為MUST-14072213，含量≥98%），鹽酸小檗堿購于中國食品藥品檢定研究院（批號為110713-200911，含量≥98%）。甲醇、乙腈（色譜純，sigma）；三乙胺、磷酸、十二烷基苯磺酸鈉、磷酸二氫鉀均為分析純。

本課題組野外采集黃連藥材15 批，含味連6 批，雅連6 批，鳳尾連3 批，均由西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科教授鑒定為黃連Coptis chinensis（味連）、三角葉黃連Coptis deltoidea（雅連）、峨眉野連Coplis omeiensis（鳳尾連）。詳細產(chǎn)地及編號見表1。

表1 黃連產(chǎn)地及編號

1.2 方法與結(jié)果1.2.1 色譜條件

色 譜 柱Angilent Eclipse XDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.4%磷酸二氫鉀（含有0.4%十二烷基磺酸鈉，0.6%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH 9.0）（34∶66）水溶液；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長345 nm；進樣量10 μL。7個生物堿的混合對照品以及3種黃連藥材HPLC圖見圖1。

圖1

1.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱定7 種對照品適量，加鹽酸甲醇溶液（1∶100），溶解制得每1 mL 含有1 mg 的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量，配制成每1 mL分別含格陵蘭黃連堿、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿為0.026、0.043、0.030、0.031、0.019、0.029、0.067 mg·mL-1的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

取黃連粉末約0.1 g（過三號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL鹽酸甲醇（1∶100），密塞，稱定重量，超聲提取45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，放置，取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察

分別精密吸取1.2.2項下各對照品儲備溶液，用鹽酸甲醇（1∶100）溶液分別稀釋成一系列濃度的混合對照品溶液。按1.2.1色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進行回歸分析，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線性范圍（表2）。結(jié)果表明，格陵蘭黃連堿、藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿7個生物堿分別在0.052 73-1.055（r=0.999 8）μg，0.085 76-1.715（r=0.999 9）μg，0.051 38-1.028（r=0.999 9）μg，0.038 45-0.769 0（r= 0.999 9）μg，0.0384 1-0.768 2（r=0.999 9）μg，0.057-1.141 0（r= 0.999 9）μg，0.134 2-2.684（r=0.999 9）μg，呈良好的線性關(guān)系。

表2 黃連生物堿含量測定結(jié)果（%，n=3）

圖2 15批黃連的HPLC特征圖

（2）精密度試驗

精密吸取同一混合生物堿對照品溶液，按1.2.1項色譜條件注入高效液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積值，計算RSD。各生物堿峰面積RSD 分別為0.97%、0.63%、0.84%、0.56%、0.54%、0.76%，表明方法有較好的精密度。

（3）穩(wěn)定性試驗

取雅連樣品0.1 g，精密稱定，按1.2.3 項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 時間按1.2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算RSD 值。峰面積的RSD 分別為1.11%、1.17%、2.89%、0.60%、0.33%、1.40%、0.63%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定可用。

（4）重復(fù)性試驗

取0.1 g 的雅連樣品6 份，精密稱定，按1.2.3 項下方法制備供試品溶液，按1.2.1項下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算含量，計算RSD 值。所測含量的RSD 分別為1.74%、1.58%、1.90%、2.16%、2.01%、2.17%、1.64%，結(jié)果表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗

取雅連樣品6 份，精密稱定，每份0.1 g，分別精密加入等量的混合對照品溶液，按1.2.3項方法制備供試品溶液，按1.2.1 項色譜條件進樣，計算加樣回收率。格陵蘭黃連堿、藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿平均回收率分別為97.07%、99.26%、101.60、99.43、98.62%、98.67%、98.68%，RSD分別為1.07%、0.66%、0.47%、0.47%、0.27%、0.37%、0.29%。表明本法具有較好的回收率。

（6）樣品測定

精密稱取黃連粉末0.1 g，按1.2.3項方法制備供試品溶液，將供試品溶液和對照品溶液各10 μL 進樣分析，分別測定不同品種黃連的生物堿含量，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明：總生物堿含量：味連＞鳳尾連＞雅連；小檗堿含量：味連＞鳳尾連＞雅連；巴馬汀含量：味連＞雅連＞鳳尾連；黃連堿：味連＞鳳尾連＞雅連；表小檗堿含量：味連＞雅連＞鳳尾連，非洲防己堿含量：味連＞鳳尾連＞雅連；藥根堿含量：雅連＞鳳尾連＞味連；格陵蘭黃連堿含量：雅連＞鳳尾連＞味連。

2 川黃連特征圖譜的建立

2.1 材料

藥材：15 批藥材（1-15 號），產(chǎn)地、品種及編號見詳表1。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 色譜條件

色 譜 柱Angilent Eclipse XDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。乙腈（A 相）-0.5%磷酸二氫鉀（三乙胺調(diào)pH=9.0）（B相）水溶液為流動相梯度洗脫。線性梯度洗脫程序為：0-15 min，10%A；15-20 min，25%A；20-25 min，30%A；25-45 min，34%A；45-85 min，50%A；85-100 min，10%A。檢測波長：305 nm；流速：0.7 mL·min-1，進樣量10 μL；柱溫35℃。

2.2.2 供試品溶液制備

取黃連粉末約0.1 g（過三號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 鹽酸甲醇，密塞，稱定重量，超聲提取45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，放置，取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 精密度試驗

取雅連藥材，按2.2.2項供試品溶液方法制備供試品溶液，按2.2.1 項色譜條件，在48 h 內(nèi)按色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以14 號色譜峰(小檗堿)為參照峰，各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD均在3.0%內(nèi)，表明該儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取2 號雅連藥材，精密稱定，按2.2.2 項供試品溶液方法制備供試品溶液，按2.2.1 項色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以14號色譜峰(小檗堿)為參照峰，各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均在3.0%內(nèi)，表明藥材供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合要求。

2.2.5 重復(fù)性試驗

取2 號雅連藥材6 份，制備供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以14 號色譜峰（小檗堿）為參照峰，各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD均在3.0%內(nèi)，表明儀器重現(xiàn)性良好。

2.2.6 15批黃連藥材特征圖譜的建立及共有峰的指認

取15 批黃連藥材，精密稱定，按2.2.2 項供試品溶液方法制備供試品溶液，按2.2.1 項色譜條件，分別進樣，記錄色譜將色譜圖通過《中藥色譜指紋圖譜評價系統(tǒng)（2012A 版）》進行相似度分析，采用平均數(shù)方法，時間窗寬度為0.3，進行自動匹配色譜峰將多個色譜圖進行比較，得到共有模式色譜圖。15 批黃連藥材特征圖譜色譜圖見圖2，特征圖譜共有模式見圖3。

通過軟件分析，選取峰面積在0.001%以上，峰形較好，分離度較好，保留時間的RSD 小于0.30%的色譜峰，結(jié)果表明，15 批黃連藥品共有15 個共有峰。黃連共有峰15個，分別編號1-15號，如圖4所示，經(jīng)與黃連生物堿對照品比對，得出14 號峰為小檗堿、13 號峰為巴馬汀，11 號峰為黃連堿、10 號峰為表小檗堿、9 號峰為非洲防己堿、8號為藥根堿、7號為格陵蘭黃連堿、2號峰為木蘭花堿。

圖3 15批黃連共有模式對照圖譜

圖4 特征峰的指認

2.2.7 不同種黃連的特征圖譜相似度分析

分別將6 批味連、6 批雅連和3 批鳳尾連的色譜圖通過《中藥色譜指紋圖譜評價系統(tǒng)（2012A版）》進行相似度分析，采用平均數(shù)方法，時間窗寬度為0.3，進行自動匹配色譜峰將多個色譜圖進行比較，得到對照特征圖譜。

結(jié)果表明，味連共有峰16 個，雅連共有峰20 個，鳳尾連共有峰21 個。通過對3 種黃連的對照指紋圖譜的相似度分析，鳳尾連與味連對照特征圖譜相似度為0.991，鳳尾連與雅連對照特征圖譜相似度為0.993，味連和雅連對照特征圖譜相似度為0.980。鳳尾連與雅連在成分上更相似。

3 討論

本文采用RP-HPLC 法對6 批味連、6 批雅連、3 批鳳尾連的生物堿含量進行了分析，建立了味連、雅連、鳳尾連的特征指紋圖譜，并標(biāo)定共有峰，味連共有峰16 個，雅連共有峰20 個，鳳尾連共有峰21 個。各批次共有峰峰面積的RSD 值均＜5%。同時測定了味連、雅連和鳳尾連3 種川產(chǎn)藥材的7 個生物堿含量。3 種川產(chǎn)黃連所含7個生物堿比例各不相同，據(jù)此可根據(jù)7個生物堿含量比例差別，來初步鑒定3種品種來源。

文獻報道的HPLC 測定的黃連及其炮制品的方法中多采用離子對色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版一部黃連項下采用十二烷基硫酸鈉，以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0），但是該條件下黃連中藥根堿和表小檗堿的分離度達不到要求。在pH 2.0 時，表小檗堿和藥根堿峰完全重合；在pH 4.0 時，表小檗堿和藥根堿略有分開；在pH 6.0 時，表小檗堿和藥根堿的分離度分別為0.94 和1.34。在pH 9.0 時，表小檗堿和藥根堿的分離度分別為11.59、4.63。本文采用三乙胺為流動相改性劑，在堿性條件下對3 種川黃連飲片中7 個生物堿進行分離，可將藥根堿、表小檗堿完全分離，實現(xiàn)了同一色譜條件下同時測定3 種川黃連飲片中7 個主要生物堿的含量。文獻報道的采用HPLC 測定黃連生物堿含量的方法，最多同時測定6個主要生物堿含量，且研究集中在味連、雅連和鳳尾連鮮有研究。在《中國藥典》2015 年版一部黃連項下也僅建立了以小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀等4個生物堿成分的一測多評法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，味連與雅連能改善2型糖尿病大鼠糖及脂代謝紊亂[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，雅連藥根堿和格陵蘭黃連堿的含量明顯高于味連，可作為雅連的特征成分，這種變化是否與雅連治療“消渴”最優(yōu)相關(guān)?是否還有其他成分的協(xié)同作用?有待進一步系統(tǒng)研究。