艾灸對慢性萎縮性胃炎大鼠外周血基因表達(dá)譜的影響＊

黃 艷，吳凌翔，馬 喆，顧沐恩，黃儒德，李 璟＊＊，吳璐一，劉慧榮，馬曉芃，張軍峰，張建斌，吳煥淦＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437；2. 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸免疫效應(yīng)重點(diǎn)研究室 上海 200030；4. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 南京 210023）

1 引言

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis, CAG）以胃黏膜腺體萎縮或消失為主要病變，是臨床常見病和多發(fā)病。本病的病因及發(fā)病機(jī)制不清，可表現(xiàn)為局限性或廣泛性的胃黏膜固有腺萎縮，多并發(fā)腸化、上皮內(nèi)瘤變及炎性反應(yīng)[1]。Correa 提出人胃癌的發(fā)生模式為正常胃黏膜-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-小腸型腸上皮化生（以下簡稱“腸化”）-上皮內(nèi)瘤變（即中重度異型增生）-胃癌（腸型）[2]，尤其是腸上皮化生，被認(rèn)為是萎縮的典型標(biāo)示及胃癌的前兆。1978 年WHO 組織將CAG 列為胃癌的癌前狀態(tài)。我國目前CAG 的發(fā)病率較高，2011 年流行病學(xué)調(diào)查顯示，CAG 發(fā)病率占受檢人群的23.2%。CAG 伴重度腸上皮化生和不典型增生的癌變率為2.0%-13.8%，而我國CAG 癌變率為3%-5%[3]。CAG的患病率隨著患者年齡及病程的增長而升高，但近年來呈低齡化趨勢。目前西醫(yī)主要是通過藥物治療和內(nèi)鏡下微創(chuàng)緩解患者的臨床癥狀，但存在一定的副反應(yīng)，患者依從性差。針刺、艾灸等方法治療CAG 的療效確切，能改善患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量[4-6]。其效應(yīng)機(jī)制尚不明確，本研究從外周血全基因組基因表達(dá)譜的角度，采用RNA-seq 高通量測序方法篩選CAG 大鼠外周血的差異表達(dá)基因，結(jié)合生物信息學(xué)分析其生物學(xué)功能，以及炎癥和腫瘤相關(guān)的信號通路，采用RT-qPCR 驗(yàn)證差異表達(dá)基因，為針灸治療CAG的效應(yīng)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室資料和研究方向。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與倫理

清潔級健康雄性Wistar 大鼠，6 周齡，體重（120±5）g，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證編號：2013001806740，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)，其飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)溫度24±2℃，濕度為40%-60%，每日明暗時(shí)間12 h/12 h。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院制定的動(dòng)物保護(hù)制度執(zhí)行；遵循《中華人民共和國動(dòng)物保護(hù)法》及上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用以及保護(hù)條款。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（日本東京株式會(huì)社，日本），戊巴比妥鈉（Sigma，美國），磁珠蛋白A（Invitrogen，美國），QubitRNA BR 檢測試劑盒（Thermo Fisher，美國），Trizol（Invitrogen，美國），Agilent 2100 RNA 芯片（Illumina，美國），RNA 6000 Nano 總RNA 分析試劑盒（Illumina，美國），Truseq 試劑盒（Illumina，美國），Truseq DNA 樣本制備試劑盒（Illumina，美國），Real-Time PCR System（Roche，美國）。

2.3 模型制備與鑒定

采用隨機(jī)的方法將大鼠分成2部分，即正常大鼠6只、造模大鼠18只。采用MNNG 誘導(dǎo)劑結(jié)合夾尾刺激與饑飽失常法復(fù)制CAG 大鼠模型。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每日自由飲用濃度為150 mg·L-1的MNNG 溶液，足量進(jìn)食2 d，禁食1 d，循環(huán)實(shí)施。每周用專用夾尾夾夾住大鼠尾部，持續(xù)10 min，使之保持激怒、爭奪。造模結(jié)束后隨機(jī)抽取正常組、造模組各2只大鼠進(jìn)行模型鑒定。

2.4 干預(yù)方法

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為隔藥餅灸組、電針組、西藥組、模型組，每組4 只；結(jié)合前面的正常組4只，共5組。

隔藥餅灸組：用附子、肉桂、黃芩等藥物按照一定比例加工碾粉備用。藥粉與黃酒混合后，用模具制成直徑為1 cm，厚度為0.45 cm 的藥餅，選用精制艾絨制成底座為1 cm，重90 mg 的艾炷。將制好的藥餅置于自制灸具內(nèi)，置于大鼠中脘穴和氣海穴上，上置艾炷，每天1次，每次每穴1壯，持續(xù)4周。

電針組：選取大鼠中脘穴和氣海穴，直刺2 mm，于針柄處接通G6805-2 型電針儀，采用連續(xù)波100 Hz，輸出電流1-3 mA，強(qiáng)度以大鼠下肢輕顫為度，每次20 min，每日1次，持續(xù)4周。

西藥組：予葉酸懸濁液1.0 mL/100 g（即葉酸2 mg·kg-1）灌胃，每天1次，持續(xù)4周。

正常組和模型組不予干預(yù)，只做與其它3 組相同的抓取和固定。

穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（余曙光主編）大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位。中脘穴：大鼠腹白線上，臍上20 mm；氣海穴：大鼠腹白線上，肚臍下12.5 mm。

2.5 標(biāo)本采集及處理

取材前各組大鼠禁食不禁水24 h，稱量體重后，2%戊巴比妥鈉麻醉（40-50 mg·kg-1）后，采用EDTA 抗凝管收集腹主動(dòng)脈血液5 mL，加Trizol 溶液3 mL，凍存-80 ℃冰箱備用。

2.6 總RNA抽提的質(zhì)控

采用Trizol 法提取總RNA，對抽提的總RNA 進(jìn)行檢測，觀察其純度、濃度及完整性。并采用安捷倫2100生物芯片分析系統(tǒng)對所得總RNA進(jìn)行質(zhì)量控制，RIN 值在8.0 以上的樣本為合格樣本，將應(yīng)用于RNAseq。

2.7 文庫建立和高通量測序

每組取3 個(gè)樣本，采用酶切的方式將各組總RNA隨機(jī)打斷成短片段，再以片斷后的RNA 作為樣本模板，用六堿基隨機(jī)引物，進(jìn)行RT-PCR 先合成cDNA 的第一鏈，并加入LIFE INVITROGEN 試劑盒（RNase H、緩沖液、dNTPs 和DNA 聚合酶I），進(jìn)行RT-PCR 合成cDNA 第二鏈，采用試劑盒純化cDNA，然后采用EB 緩沖液洗脫柱子，完成末端修復(fù)、末端加堿基A，再加測序接頭index，然后通過Uracil-N-Glycosylase 降解第二條鏈。將所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，取出合適的大小片段，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。建好文庫后，采用高通量測序儀Illumina HiSeqTM 2000測序。本部分由深圳華大基因股份有限公司完成。

表1 引物的序列表

2.8 生物信息學(xué)分析

本部分主要采用了TOPHAT 和CUFFLINKS 結(jié)合分析的方法。過濾掉FPKM 和覆蓋度較低的序列，減少背景噪聲，組裝的轉(zhuǎn)錄本然后再與已知的mRNA 參考序列比較，得到所有基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄本。差異表達(dá)基因篩選條件為：log2FC（Fold change）≥1 為基因表達(dá)上調(diào)；log2FC≤-1為基因表達(dá)下調(diào)，probility＞0.6。

2.9 RT-qPCR驗(yàn)證

選取Foxo3、Ifnk、Uba52、S100a1、Nod2共5 個(gè)差異表達(dá)基因，以GAPDH為內(nèi)參基因，各組4 個(gè)樣本進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證?；蛞镄蛄幸姳?。所有數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，描述數(shù)據(jù)時(shí)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[Median(P25-P75)]表示。通過正態(tài)分布檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法。若不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的大體情況觀察

正常組的大鼠毛發(fā)光澤，緊密貼身，兩眼有神，尾淡紅，體型健壯，大便呈顆粒狀。模型組的大鼠毛發(fā)蓬亂且毛發(fā)易脫落，眼珠無神，尾淡白或蒼白，體型瘦削，活動(dòng)遲緩，進(jìn)食少，糞便偏軟、時(shí)不成形。隔藥餅灸組、電針組和西藥組的大鼠毛發(fā)稀疏，較模型組改善、精神轉(zhuǎn)佳，活動(dòng)較靈活，體重有所增加，進(jìn)食稍增加，糞便偏軟、時(shí)不成形。

3.2 CAG大鼠外周血的基因表達(dá)譜研究

3.2.1 CAG大鼠外周血的差異表達(dá)基因

CAG 大鼠與正常大鼠外周全血基因表達(dá)譜變化。與正常組比較，CAG 組有1 542 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因725個(gè)，下調(diào)基因817個(gè)（圖1）。

圖1 CAG大鼠模型組外周全血基因表達(dá)譜MA圖

3.2.2 基因本體（GO）分析

與CAG 大鼠外周全血差異表達(dá)基因相關(guān)的GO分析提示，分子功能：與抗氧化活性、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合及結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)。生物學(xué)途徑：與單一生物過程、信號、應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)生物過程、突觸、正反饋和負(fù)反饋、代謝過程、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞成分和生物作用、生物粘附等相關(guān)。細(xì)胞組件：與細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)、大分子復(fù)合物、膜、細(xì)胞器、突觸等相關(guān)（圖2）。

圖2 CAG大鼠外周血差異表達(dá)基因的GO分析

3.2.3 信號通路（KEGG）分析

與CAG 大鼠外周全血差異表達(dá)基因相關(guān)的KEGG 分析提示，主要與細(xì)胞生長和死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸和分解代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子和相互作用、癌癥、心血管疾病、內(nèi)分泌代謝疾病、免疫疾病、細(xì)菌感染、神經(jīng)退行性疾病、物質(zhì)依賴、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、糖鏈生物合成和代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、核苷酸代謝、異生素生物降解和代謝、衰老、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、環(huán)境適應(yīng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、感覺系統(tǒng)等相關(guān)（圖3）。

3.3 隔藥餅灸、電針和西藥對CAG 大鼠外周血表達(dá)基因譜的影響

MNNG 誘導(dǎo)的CAG 大鼠在隔藥灸干預(yù)作用下，外周血較模型組的差異表達(dá)基因2 956 個(gè)，其中上調(diào)1 012 個(gè)，下調(diào)1 944 個(gè)。下調(diào)基因數(shù)目明顯多于上調(diào)基因數(shù)目，占65.76%。電針干預(yù)作用下，外周血較模型組的差異表達(dá)基因3 136 個(gè)，其中有的上調(diào)885 個(gè)，有部分下調(diào)2 251 個(gè)。下調(diào)基因數(shù)目明顯多于上調(diào)基因數(shù)目，占71.78%。在西藥組的干預(yù)下，外周血較模型組的差異表達(dá)基因1 308 個(gè)，其中有的上調(diào)703 個(gè)，有部分下調(diào)605個(gè)。上調(diào)基因數(shù)目稍多于下調(diào)基因數(shù)目，占53.75%。

圖3 CAG大鼠外周全血差異表達(dá)基因的KEGG分析

3.3.1 隔藥餅灸干預(yù)CAG 模型大鼠外周全血的基因表達(dá)譜研究

（1）隔藥餅灸干預(yù)CAG 模型大鼠外周血的差異表達(dá)基因

隔藥餅灸組大鼠與CAG 模型大鼠外周全血基因表達(dá)譜變化，與模型組比較，隔藥餅灸組有2 956 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)1 012個(gè)，下調(diào)1 944個(gè)（圖4）。

圖4 隔藥餅灸組與CAG模型組外周全血基因表達(dá)譜MA圖

（2）基因本體（GO）分析

隔藥餅灸干預(yù)CAG 大鼠的外周全血差異表達(dá)基因相關(guān)的GO 分析提示，分子功能：與抗氧化活性、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合及結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)。生物學(xué)途徑：與單一生物過程、信號、應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)生物過程、突觸、正反饋和負(fù)反饋、代謝過程、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞成分和生物作用、生物粘附等相關(guān)。細(xì)胞組件：與細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)、大分子復(fù)合物、膜、細(xì)胞器、突觸等相關(guān)（圖5）。

圖5 隔藥餅灸組大鼠外周全血基因表達(dá)譜GO分析

（3）KEGG分析

隔藥餅灸組外周全血的差異基因的KEGG分析結(jié)果提示，其中基因涉及KEGG主要與細(xì)胞生長與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)折疊與分選、復(fù)制與修復(fù)、癌癥、免疫疾病、物質(zhì)氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等相關(guān)（圖6）。

3.3.2 電針干預(yù)CAG 模型大鼠外周全血的基因表達(dá)譜研究

（1）電針干預(yù)CAG 模型大鼠外周血的差異表達(dá)基因

電針組大鼠與CAG 模型大鼠外周全血基因表達(dá)譜變化，與模型組比較，電針組有3136 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)885個(gè)，下調(diào)2251個(gè)（圖7）。

圖6 隔藥餅灸組大鼠外周全血基因表達(dá)譜KEGG分析

圖7 電針組與CAG模型組外周全血基因表達(dá)譜MA圖

（2）GO分析

電針干預(yù)CAG 大鼠的外周全血差異表達(dá)基因相關(guān)的GO 分析提示，分子功能：與抗氧化、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合及分子活性相關(guān)。生物學(xué)途徑：與單一生物過程、信號、應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)生物過程、正反饋和負(fù)反饋、代謝過程、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞成分和生物作用、生物粘附等相關(guān)。 細(xì)胞組件：與突觸、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞、細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)、大分子復(fù)合物等細(xì)胞組件相關(guān)（圖8）。

圖8 電針組大鼠外周全血基因表達(dá)譜GO分析

（3）KEGG分析

電針組外周全血的差異基因的KEGG分析結(jié)果提示，其中基因涉及KEGG主要與細(xì)胞生長與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)折疊與分選、復(fù)制與修復(fù)、癌癥、免疫疾病、物質(zhì)氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等相關(guān)（圖9）。

圖9 電針組大鼠外周全血基因表達(dá)譜KEGG分析

3.3.3 西藥干預(yù)CAG 模型大鼠外周全血的基因表達(dá)譜研究

（1）西藥干預(yù)CAG 模型大鼠外周全血的差異表達(dá)基因

西藥組大鼠與CAG 模型大鼠外周全血基因表達(dá)譜變化。與模型組比較，西藥組有1 308 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)703個(gè)，下調(diào)605個(gè)（圖10）。

圖10 西藥組與CAG模型組外周全血基因表達(dá)譜MA圖

（2）GO分析

西藥干預(yù)CAG 大鼠的外周全血差異表達(dá)基因相關(guān)的GO 分析提示，分子功能：與抗氧化活性、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合及結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)。生物學(xué)途徑：與單一生物過程、信號、應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)生物過程、突觸、正反饋和負(fù)反饋、代謝過程、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞成分和生物作用、生物粘附等相關(guān)。細(xì)胞組件：與細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)、大分子復(fù)合物、膜、細(xì)胞器、突觸等相關(guān)（圖11）。

圖11 西藥組大鼠外周全血基因表達(dá)譜GO分析

（3）KEGG分析

西藥組外周全血的差異基因的KEGG分析結(jié)果提示，其中基因涉及KEGG主要與細(xì)胞生長與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、免疫疾病、物質(zhì)氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等相關(guān)（圖12）。

圖12 西藥組大鼠外周全血基因表達(dá)譜KEGG分析

3.4 隔藥餅灸影響的CAG 外周全血差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

RNA-seq 測序結(jié)果提示，CAG 大鼠外周全血Foxo3、Ifnk和Uba52較正常組下調(diào)，S100a1、Nod2較正常組上調(diào)。采用RT-qPCR 驗(yàn)證這5 個(gè)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAG大鼠外周全血基因Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表達(dá)均較正常組降低（P＜0.05），IfnkmRNA 表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CAG 大鼠外周全血S100a1mRNA、Nod2mRNA 表達(dá)均較正常組上調(diào)（P＜0.05）。經(jīng)3 種干預(yù)方法作用后，隔藥餅灸組、電針組、西藥組CAG大鼠外周全血Foxo3mRNA、Uba52mRNA均較模型組上調(diào)（P＜0.05），S100a1、Nod2較模型組下調(diào)（P＜0.05），三組IfnkmRNA 表達(dá)較模型組有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖13）。

圖13 各組部分外周全血差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

4 討論

CAG 在中醫(yī)學(xué)古籍中沒有相關(guān)記載，2010年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)正式將CAG 歸屬為“胃痞”、“胃痛”、“嘈雜”、“痞滿”、“腹脹”等范疇。本病發(fā)病多與稟賦不足、勞倦過度、飲食不節(jié)、情志不調(diào)、感受外邪等因素相關(guān)，病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，病情遷延難愈，早期多因外邪、飲食、情致等所傷為實(shí)證，后期病機(jī)逐漸演變?yōu)槠⑽柑撊醯忍撟C，屬本虛標(biāo)實(shí)。相對于西醫(yī)學(xué)主張對癥治療的觀點(diǎn)，中醫(yī)學(xué)更側(cè)重于整體調(diào)節(jié)和辨證論治。針刺、艾灸等方法治療CAG 的療效確切，相關(guān)臨床研究已證實(shí)[4-9]，本研究采用隔藥餅灸方法治療CAG，以充分發(fā)揮經(jīng)絡(luò)、腧穴及藥物的治療作用。

隨著基因芯片和RNA-seq 高通量測序技術(shù)的發(fā)展，CAG 疾病相關(guān)的基因及其生物學(xué)功能逐漸被揭示，CAG 胃黏膜組織部分炎癥因子、促癌基因和抑癌基因異常表達(dá)。我們思考隔藥餅灸對CAG 發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞凋亡的作用，以及調(diào)控促癌基因與抑癌基因的平衡。本研究從全基因組基因表達(dá)譜的角度，采用RNA-seq 高通量測序的方法，探討MNNG 誘導(dǎo)的CAG 外周全血基因表達(dá)譜，并篩選隔藥餅灸中脘、氣海穴逆轉(zhuǎn)CAG 大鼠外周全血的差異表達(dá)基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，MNNG 誘導(dǎo)的CAG 大鼠在3 種干預(yù)方法的作用下，外周血差異表達(dá)基因均有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，其中隔藥餅灸和電針調(diào)控的差異基因數(shù)目較西藥多，可能與針灸作用的多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)相關(guān)。3 種干預(yù)方法作用下的KEGG 途徑富集分析主要與細(xì)胞生長與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、免疫疾病、能量代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等相關(guān)，富集基因數(shù)目最多的通路主要與蛋白翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等相關(guān)。

GAG 大鼠外周血差異基因表達(dá)譜廣泛，我們篩選了差異倍數(shù)較顯著的Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2、Ifnk等5個(gè)基因，RNA-seq測序結(jié)果提示，CAG大鼠外周全血Foxo3、Ifnk和Uba52較正常組下調(diào)，S100a1、Nod2較正常組上調(diào)。采用RT-qPCR 對RNA-seq 測序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAG 大鼠外周全血基因Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表達(dá)均較正常組降低，S100a1mRNA、Nod2mRNA 表達(dá)均較正常組升高，IfnkmRNA表達(dá)均較正常組亦有降低趨勢；經(jīng)3 種干預(yù)方法作用后，CAG 大鼠外周全血Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表達(dá)均較模型組升高，S100a1、Nod2表達(dá)均較模型組降低，IfnkmRNA 表達(dá)較模型組亦有上升趨勢。研究表明，叉頭蛋白Foxo3 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等的病理過程，可通過激活PI3K-AKT 信號通路參與CAG癌前病變的調(diào)節(jié)，與消化道腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10-14]。S100a1是鈣結(jié)合蛋白S100家族的成員，在細(xì)胞中既有信號分子的作用同時(shí)又可作為分泌蛋白起作用，與多種神經(jīng)病變、癌癥相關(guān)[15，16]，研究表明，S100a1 可通過刺激胃癌細(xì)胞內(nèi)鈣水平在胃癌細(xì)胞呈高表達(dá)趨勢[17]。UBA52 是由泛素和核糖體蛋白L40 組成的融合蛋白，其主要參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，并與結(jié)腸癌、乳腺癌等相關(guān)[18-21]。HP 感染是CAG 重要的危險(xiǎn)因素，NOD2 作為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白家族的關(guān)鍵成員，可通過識別和清除外源性病原微生物、介導(dǎo)天然免疫，是抵御Hp 感染的第一道防線，并參與Hp 相關(guān)胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程[22-25]。Ifnk（interferon kappa,IFN-κ）是近來發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型干擾素家族成員，在先天免疫應(yīng)答期起著重要作用，具有與其它Ⅰ型干擾素家族成員相似的抗病毒感染的功能[26,27]。綜上，本研究所驗(yàn)證的Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2等4 個(gè)差異基因的mRNA 表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致，可能是CAG 的潛在的生物標(biāo)志物；在隔藥餅灸的干預(yù)作用下，F(xiàn)oxo3、Uba52、S100a1、Nod2的mRNA 表達(dá)水平均有不同程度的逆轉(zhuǎn)，可能是隔藥餅灸干預(yù)CAG 大鼠的外周血的作用機(jī)制之一。

基因表達(dá)譜研究為我們提供了研究方向，下一步將從表觀遺傳的角度結(jié)合RNA-seq 基因表達(dá)譜，研究DNA 甲基化和長鏈非編碼RNA 在艾灸治療CAG 的效應(yīng)機(jī)制。